Диференціальна діагностика легеневих вузликів, виявлених за допомогою комп'ютерної томографії (КТ), залишається проблемою в клінічній практиці. Тут ми характеризуємо глобальний метаболом 480 зразків сироватки, включаючи здорових людей контрольної групи, доброякісні вузлики легень та аденокарциному легень I стадії. Аденокарциноми демонструють унікальні метаболомні профілі, тоді як доброякісні вузлики та здорові особи мають високу схожість у метаболомних профілях. У групі виявлення (n = 306) було ідентифіковано набір з 27 метаболітів для диференціації доброякісних та злоякісних вузликів. AUC дискримінантної моделі у групах внутрішньої валідації (n = 104) та зовнішньої валідації (n = 111) становила 0,915 та 0,945 відповідно. Аналіз шляхів виявив збільшення гліколітичних метаболітів, пов'язане зі зниженням рівня триптофану в сироватці крові аденокарциноми легень порівняно з доброякісними вузликами та здоровими людьми контрольної групи, і припустив, що поглинання триптофану сприяє гліколізу в клітинах раку легень. Наше дослідження підкреслює цінність біомаркерів сироваткових метаболітів для оцінки ризику виникнення легеневих вузликів за допомогою КТ.
Рання діагностика має вирішальне значення для покращення показників виживання онкологічних хворих. Результати Національного дослідження скринінгу раку легень США (NLST) та Європейського дослідження NELSON показали, що скринінг за допомогою низькодозової комп'ютерної томографії (LDCT) може значно знизити смертність від раку легень у групах високого ризику1,2,3. З моменту широкого використання LDCT для скринінгу раку легень частота випадкових рентгенологічних знахідок безсимптомних легеневих вузликів продовжує зростати4. Легеневі вузлики визначаються як вогнищеві помутніння діаметром до 3 см5. Ми стикаємося з труднощами в оцінці ймовірності злоякісності та роботі з великою кількістю легеневих вузликів, випадково виявлених на LDCT. Обмеження КТ можуть призвести до частих повторних обстежень та хибнопозитивних результатів, що призводить до непотрібного втручання та надмірного лікування6. Тому існує потреба в розробці надійних та корисних біомаркерів для правильної ідентифікації раку легень на ранніх стадіях та диференціації більшості доброякісних вузликів при первинному виявленні7.
Комплексний молекулярний аналіз крові (сироватки, плазми, мононуклеарних клітин периферичної крові), включаючи геноміку, протеоміку або метилювання ДНК8,9,10, призвів до зростаючого інтересу до відкриття діагностичних біомаркерів раку легенів. Тим часом, метаболомічні підходи вимірюють кінцеві продукти клітини, на які впливають ендогенні та екзогенні дії, і тому застосовуються для прогнозування початку та результату захворювання. Рідинна хроматографія-тандемна мас-спектрометрія (LC-MS) є широко використовуваним методом метаболомічних досліджень завдяки своїй високій чутливості та широкому динамічному діапазону, який може охоплювати метаболіти з різними фізико-хімічними властивостями11,12,13. Хоча глобальний метаболомний аналіз плазми/сироватки використовувався для ідентифікації біомаркерів, пов'язаних з діагностикою раку легенів14,15,16,17 та ефективністю лікування18, класифікатори сироваткових метаболітів для розрізнення доброякісних та злоякісних вузликів легенів ще потребують значного вивчення. -масштабні дослідження.
Аденокарцинома та плоскоклітинна карцинома – це два основні підтипи недрібноклітинного раку легень (НМРЛ). Різні скринінгові тести на комп'ютерній томографії (КТ) показують, що аденокарцинома є найпоширенішим гістологічним типом раку легень1,19,20,21. У цьому дослідженні ми використовували ультрапродуктивну рідинну хроматографію з високою роздільною здатністю (UPLC-HRMS) для проведення метаболомного аналізу загалом 695 зразків сироватки крові, включаючи здорових людей контрольної групи, доброякісні вузлики легень та виявлені на КТ ≤3 см. Скринінг на аденокарциному легень I стадії. Ми визначили панель метаболітів сироватки крові, які відрізняють аденокарциному легень від доброякісних вузликів та здорових людей контрольної групи. Аналіз збагачення метаболізму показав, що порушення метаболізму триптофану та глюкози є поширеними змінами при аденокарциномі легень порівняно з доброякісними вузликами та здоровими людьми контрольної групи. Нарешті, ми створили та валідували класифікатор метаболізму сироватки крові з високою специфічністю та чутливістю для розрізнення злоякісних та доброякісних вузликів легень, виявлених за допомогою КТ, що може допомогти в ранній диференціальній діагностиці та оцінці ризику.
У цьому дослідженні зразки сироватки крові, зібрані за статтю та віком, були ретроспективно зібрані у 174 здорових осіб контрольної групи, 292 пацієнтів з доброякісними вузликами легень та 229 пацієнтів з аденокарциномою легень I стадії. Демографічні характеристики 695 учасників наведено у Додатковій таблиці 1.
Як показано на рисунку 1a, в Онкологічному центрі Університету Сунь Ятсена було зібрано загалом 480 зразків сироватки, включаючи 174 зразки здорової контрольної групи (HC), 170 доброякісних вузликів (BN) та 136 зразків аденокарциноми легень (LA) I стадії. Когорта виявлення для нецільового метаболомічного профілювання за допомогою ультрапродуктивної рідинної хроматографії з високою роздільною здатністю (UPLC-HRMS). Як показано на додатковому рисунку 1, були ідентифіковані диференціальні метаболіти між LA та HC, LA та BN для створення моделі класифікації та подальшого дослідження аналізу диференціальних шляхів. 104 зразки, зібрані Онкологічним центром Університету Сунь Ятсена, та 111 зразків, зібраних двома іншими лікарнями, пройшли внутрішню та зовнішню валідацію відповідно.
a Досліджувана популяція в когорті виявлення, яка пройшла глобальний аналіз метаболому сироватки крові за допомогою ультрапродуктивної рідинної хроматографії з високою роздільною здатністю (UPLC-HRMS). b Дискримінантний аналіз методом часткових найменших квадратів (PLS-DA) загального метаболому 480 зразків сироватки крові з досліджуваної когорти, включаючи здорових людей контрольної групи (HC, n = 174), доброякісні вузлики (BN, n = 170) та аденокарциному легень I стадії (Лос-Анджелес, n = 136). +ESI, режим позитивної електророзпилювальної іонізації, -ESI, режим негативної електророзпилювальної іонізації. c–e Метаболіти зі значно різною кількістю у двох заданих групах (двосторонній знаковий ранговий тест Вілкоксона, скориговане на рівень хибного виявлення значення p, FDR <0,05) показані червоним (кратність зміни > 1,2) та синім (кратність зміни < 0,83). ) показано на графіці вулкана. f Ієрархічна теплова карта кластеризації, що показує значні відмінності в кількості анотованих метаболітів між LA та BN. Вихідні дані надаються у вигляді файлів вихідних даних.
Загальний метаболом сироватки крові 174 HC, 170 BN та 136 LA у групі дослідження було проаналізовано за допомогою аналізу UPLC-HRMS. Спочатку ми показуємо, що зразки контролю якості (QC) щільно кластеруються в центрі моделі аналізу головних компонентів без нагляду (PCA), що підтверджує стабільність результатів поточного дослідження (Додатковий рисунок 2).
Як показано в дискримінантному аналізі часткових найменших квадратів (PLS-DA) на рисунку 1b, ми виявили чіткі відмінності між LA та BN, LA та HC в режимах позитивної (+ESI) та негативної (−ESI) електророзпилювальної іонізації. Однак суттєвих відмінностей між BN та HC в умовах +ESI та -ESI не було виявлено.
Ми виявили 382 диференціальні ознаки між LA та HC, 231 диференціальну ознаку між LA та BN, та 95 диференціальних ознак між BN та HC (тест знакових рангів Вілкоксона, FDR <0,05 та множинні зміни >1,2 або <0,83) (Рисунок .1c-e). Піки були додатково анотовані (Додаткові дані 3) у базі даних (бібліотека mzCloud/HMDB/Chemspider) за значенням m/z, часом утримування та пошуком за мас-спектром фрагментації (деталі описані в розділі Методи)22. Нарешті, було ідентифіковано 33 та 38 анотованих метаболітів зі значними відмінностями в кількості для LA проти BN (Рисунок 1f та Додаткова таблиця 2) та LA проти HC (Додатковий рисунок 3 та Додаткова таблиця 2) відповідно. На противагу цьому, лише 3 метаболіти зі значними відмінностями в кількості були ідентифіковані в BN та HC (Додаткова таблиця 2), що узгоджується з перекриттям між BN та HC у PLS-DA. Ці диференціальні метаболіти охоплюють широкий спектр біохімічних речовин (Додатковий рисунок 4). У сукупності ці результати демонструють значні зміни в метаболомі сироватки крові, що відображають злоякісну трансформацію раку легенів на ранній стадії порівняно з доброякісними вузликами легенів або здоровими суб'єктами. Тим часом, подібність метаболому сироватки крові BN та HC свідчить про те, що доброякісні легеневі вузлики можуть мати багато спільних біологічних характеристик зі здоровими людьми. Враховуючи, що мутації гена рецептора епідермального фактора росту (EGFR) є поширеними при аденокарциномі легенів підтипу 23, ми прагнули визначити вплив драйверних мутацій на метаболом сироватки крові. Потім ми проаналізували загальний метаболомний профіль 72 випадків зі статусом EGFR у групі аденокарциноми легенів. Цікаво, що ми виявили порівнянні профілі між пацієнтами з мутацією EGFR (n = 41) та пацієнтами з диким типом EGFR (n = 31) в аналізі PCA (Додатковий рисунок 5a). Однак, ми виявили 7 метаболітів, чисельність яких була значно змінена у пацієнтів з мутацією EGFR порівняно з пацієнтами з EGFR дикого типу (t-тест, p < 0,05 та кратність зміни > 1,2 або < 0,83) (Додатковий рисунок 5b). Більшість цих метаболітів (5 з 7) є ацилкарнітинами, які відіграють важливу роль у шляхах окислення жирних кислот.
Як показано в робочому процесі, показаному на рисунку 2a, біомаркери для класифікації вузликів були отримані за допомогою операторів найменшого абсолютного зморщення та відбору на основі 33 диференціальних метаболітів, ідентифікованих у LA (n = 136) та BN (n = 170). Найкраща комбінація змінних (LASSO) – модель бінарної логістичної регресії. Для перевірки надійності моделі було використано десятикратну перехресну валідацію. Відбір змінних та регуляризація параметрів скориговані штрафом за максимізацію правдоподібності з параметром λ24. Глобальний метаболомічний аналіз було додатково проведено незалежно у групах внутрішньої валідації (n = 104) та зовнішньої валідації (n = 111) для перевірки ефективності класифікації дискримінантної моделі. В результаті 27 метаболітів у наборі для виявлення були ідентифіковані як найкраща дискримінантна модель з найбільшим середнім значенням AUC (рис. 2b), серед яких 9 мали підвищену активність, а 18 – знижену активність у LA порівняно з BN (рис. 2c).
Робочий процес для побудови класифікатора легеневих вузликів, включаючи вибір найкращої панелі сироваткових метаболітів у наборі для виявлення за допомогою бінарної логістичної регресійної моделі шляхом десятикратної перехресної валідації та оцінку прогностичної ефективності у внутрішніх та зовнішніх наборах валідації. b Статистика перехресної валідації регресійної моделі LASSO для вибору метаболічних біомаркерів. Наведені вище числа представляють середню кількість біомаркерів, вибраних при заданому λ. Червона пунктирна лінія представляє середнє значення AUC при відповідній лямбда. Сірі смуги похибки представляють мінімальні та максимальні значення AUC. Пунктірна лінія вказує на найкращу модель з 27 вибраними біомаркерами. AUC, площа під кривою ROC (Receiver Operating Characteristic). c Зміни кратності 27 вибраних метаболітів у групі LA порівняно з групою BN у групі виявлення. Червоний стовпець – активація. Синій стовпець – зниження. d–f Криві ROC (Receiver Operating Characteristic), що показують потужність дискримінантної моделі на основі 27 комбінацій метаболітів у наборах для виявлення, внутрішньої та зовнішньої валідації. Вихідні дані надаються у вигляді файлів вихідних даних.
Модель прогнозування була створена на основі зважених коефіцієнтів регресії цих 27 метаболітів (Додаткова таблиця 3). ROC-аналіз на основі цих 27 метаболітів показав значення площі під кривою (AUC) 0,933, чутливість групи виявлення становила 0,868, а специфічність – 0,859 (рис. 2d). Тим часом, серед 38 анотованих диференціальних метаболітів між LA та HC, набір із 16 метаболітів досяг AUC 0,902 з чутливістю 0,801 та специфічністю 0,856 при розрізненні LA від HC (Додаткові рисунки 6a-c). Також порівнювалися значення AUC, засновані на різних порогах зміни кратності для диференціальних метаболітів. Ми виявили, що модель класифікації найкраще розрізняла LA та BN (HC), коли рівень зміни кратності був встановлений на 1,2 проти 1,5 або 2,0 (Додаткові рисунки 7a,b). Модель класифікації, заснована на 27 групах метаболітів, була додатково валідована у внутрішніх та зовнішніх когортах. Площа під кривою (AUC) становила 0,915 (чутливість 0,867, специфічність 0,811) для внутрішньої валідації та 0,945 (чутливість 0,810, специфічність 0,979) для зовнішньої валідації (рис. 2e, f). Для оцінки міжлабораторної ефективності 40 зразків із зовнішньої когорти було проаналізовано у зовнішній лабораторії, як описано в розділі «Методи». Точність класифікації досягла AUC 0,925 (Додатковий рисунок 8). Оскільки плоскоклітинний рак легенів (LUSC) є другим за поширеністю підтипом недрібноклітинного раку легенів (НДРЛ) після аденокарциноми легенів (LUAD), ми також перевірили валідовану потенційну корисність метаболічних профілів. BN та 16 випадків LUSC. Площа під кривою (AUC) для розрізнення LUSC та BN становила 0,776 (Додатковий рисунок 9), що вказує на гіршу здатність порівняно з розрізненням між LUAD та BN.
Дослідження показали, що розмір вузликів на КТ-зображеннях позитивно корелює з ймовірністю злоякісного новоутворення та залишається основним фактором, що визначає лікування вузликів25,26,27. Аналіз даних великої когорти скринінгового дослідження NELSON показав, що ризик злоякісного новоутворення у пацієнтів з вузлами <5 мм був навіть подібним до ризику у пацієнтів без вузлів28. Таким чином, мінімальний розмір, що вимагає регулярного КТ-моніторингу, становить 5 мм, як рекомендовано Британським торакальним товариством (BTS), та 6 мм, як рекомендовано Товариством Флейшнера29. Однак вузлики розміром більше 6 мм та без очевидних доброякісних ознак, які називаються невизначеними легеневими вузликами (IPN), залишаються серйозною проблемою в оцінці та лікуванні в клінічній практиці30,31. Далі ми дослідили, чи впливає розмір вузликів на метаболомні сигнатури, використовуючи об'єднані зразки з когорт виявлення та внутрішньої валідації. Зосередившись на 27 валідованих біомаркерах, ми спочатку порівняли профілі PCA метаболомів HC та BN розміром менше 6 мм. Ми виявили, що більшість точок даних для HC та BN перекривалися, що демонструє подібність рівнів метаболітів у сироватці крові в обох групах (рис. 3a). Карти ознак для різних діапазонів розмірів залишалися збереженими в BN та LA (рис. 3b, c), тоді як спостерігалося розділення між злоякісними та доброякісними вузликами в діапазоні 6–20 мм (рис. 3d). Ця когорта мала AUC 0,927, специфічність 0,868 та чутливість 0,820 для прогнозування злоякісності вузликів розміром від 6 до 20 мм (рис. 3e, f). Наші результати показують, що класифікатор може враховувати метаболічні зміни, спричинені ранньою злоякісною трансформацією, незалежно від розміру вузлика.
ad Порівняння профілів PCA між заданими групами на основі метаболічного класифікатора з 27 метаболітів. CC та BN < 6 мм. b BN < 6 мм проти BN 6–20 мм. у LA 6–20 мм проти LA 20–30 мм. g BN 6–20 мм та LA 6–20 мм. GC, n = 174; BN < 6 мм, n = 153; BN 6–20 мм, n = 91; LA 6–20 мм, n = 89; LA 20–30 мм, n = 77. e Крива ROC (Receiver Operating Character), що показує ефективність дискримінантної моделі для вузликів 6–20 мм. f Значення ймовірності були розраховані на основі логістичної регресійної моделі для вузликів розміром 6–20 мм. Сіра пунктирна лінія представляє оптимальне граничне значення (0,455). Наведені вище числа представляють відсоток випадків, прогнозованих для Лос-Анджелеса. Використовуйте двосторонній t-критерій Стьюдента. PCA, аналіз головних компонент. Площа під кривою AUC. Вихідні дані надаються у вигляді файлів вихідних даних.
Чотири зразки (віком 44–61 років) з подібними розмірами легеневих вузликів (7–9 мм) були додатково відібрані для ілюстрації ефективності запропонованої моделі прогнозування злоякісності (рис. 4a, b). Під час початкового скринінгу Випадок 1 проявлявся як щільний вузлик з кальцифікацією, що асоціюється з доброякісністю, тоді як Випадок 2 проявлявся як невизначений частково щільний вузлик без очевидних доброякісних ознак. Три раунди подальших комп'ютерних томографій показали, що ці випадки залишалися стабільними протягом 4-річного періоду і тому вважалися доброякісними вузликами (рис. 4a). Порівняно з клінічною оцінкою серійних комп'ютерних томографій, одноразовий аналіз метаболітів сироватки крові за допомогою поточної моделі класифікатора швидко та правильно ідентифікував ці доброякісні вузлики на основі ймовірнісних обмежень (табл. 1). На рисунку 4b у випадку 3 показано вузлик з ознаками плевральної ретракції, яка найчастіше асоціюється зі злоякісністю32. Випадок 4 проявлявся як невизначений частково щільний вузлик без ознак доброякісної причини. Усі ці випадки були прогнозовані як злоякісні згідно з моделлю класифікатора (табл. 1). Оцінку аденокарциноми легень було продемонстровано за допомогою гістопатологічного дослідження після операції резекції легень (рис. 4b). Для зовнішнього валідаційного набору метаболічний класифікатор точно передбачив два випадки невизначених вузликів у легенях розміром понад 6 мм (додатковий рисунок 10).
КТ-зображення аксіального вікна легень двох випадків доброякісних вузликів. У випадку 1, КТ-сканування через 4 роки показало стабільний щільний вузлик розміром 7 мм з кальцифікацією в правій нижній частці. У випадку 2, КТ-сканування через 5 років виявило стабільний, частково щільний вузлик діаметром 7 мм у правій верхній частці. b. Аксіальні КТ-зображення легень та відповідні патологічні дослідження двох випадків аденокарциноми I стадії до резекції легені. У випадку 3 виявлено вузлик діаметром 8 мм у правій верхній частці з плевральною ретракцією. У випадку 4 виявлено частково щільний вузлик типу матового скла розміром 9 мм у лівій верхній частці. Фарбування резектованої тканини легені гематоксиліном та еозином (H&E) (масштабна шкала = 50 мкм), що демонструє ацинарний характер росту аденокарциноми легені. Стрілки вказують на вузлики, виявлені на КТ-зображеннях. H&E-зображення є репрезентативними зображеннями кількох (>3) мікроскопічних полів, досліджених патологоанатомом.
У сукупності наші результати демонструють потенційну цінність біомаркерів метаболітів сироватки крові в диференціальній діагностиці легеневих вузликів, що може створювати труднощі при оцінці результатів комп'ютерної томографії.
На основі валідованої диференціальної панелі метаболітів ми прагнули визначити біологічні кореляти основних метаболічних змін. Аналіз збагачення шляхів KEGG, проведений MetaboAnalyst, виявив 6 спільних суттєво змінених шляхів між двома заданими групами (LA проти HC та LA проти BN, скоригований p ≤ 0,001, ефект > 0,01). Ці зміни характеризувалися порушеннями метаболізму пірувату, метаболізму триптофану, метаболізму ніацину та нікотинаміду, гліколізу, циклу TCA та метаболізму пуринів (рис. 5a). Потім ми додатково провели цільову метаболоміку для перевірки основних змін за допомогою абсолютної кількісної оцінки. Визначення спільних метаболітів у спільно змінених шляхах за допомогою потрійної квадрупольної мас-спектрометрії (QQQ) з використанням автентичних стандартів метаболітів. Демографічні характеристики цільової вибірки дослідження метаболоміки включені до Додаткової таблиці 4. Відповідно до наших глобальних результатів метаболоміки, кількісний аналіз підтвердив, що рівень гіпоксантину та ксантину, пірувату та лактату був підвищений у LA порівняно з BN та HC (рис. 5b, c, p <0,05). Однак суттєвих відмінностей у цих метаболітах між BN та HC не виявлено.
Аналіз збагачення сигнального шляху KEGG для суттєво різних метаболітів у групі LA порівняно з групами BN та HC. Був використаний двосторонній глобальний тест, а значення p були скориговані за допомогою методу Холма-Бонферроні (скориговане p ≤ 0,001 та розмір ефекту > 0,01). b–d Скрипкові діаграми, що показують рівні гіпоксантину, ксантину, лактату, пірувату та триптофану в сироватці крові HC, BN та LA, визначені за допомогою LC-MS/MS (n = 70 на групу). Білі та чорні пунктирні лінії позначають медіану та квартиль відповідно. e Скрипкова діаграма, що показує нормалізовану експресію мРНК Log2TPM (транскриптів на мільйон) SLC7A5 та QPRT в аденокарциномі легень (n = 513) порівняно з нормальною тканиною легень (n = 59) у наборі даних LUAD-TCGA. Біла рамка представляє міжквартильний діапазон, горизонтальна чорна лінія в центрі представляє медіану, а вертикальна чорна лінія, що простягається від рамки, представляє 95% довірчий інтервал (ДІ). f Графік кореляції Пірсона експресії SLC7A5 та GAPDH в аденокарциномі легень (n = 513) та нормальній тканині легень (n = 59) у наборі даних TCGA. Сіра область представляє 95% ДІ. r – коефіцієнт кореляції Пірсона. g Нормалізовані рівні триптофану в клітинах A549, трансфікованих неспецифічним контролем shRNA (NC) та shSLC7A5 (Sh1, Sh2), визначені за допомогою LC-MS/MS. Представлено статистичний аналіз п'яти біологічно незалежних зразків у кожній групі. h Клітинні рівні NADt (загальний NAD, включаючи NAD+ та NADH) у клітинах A549 (NC) та клітинах A549 з нокдауном SLC7A5 (Sh1, Sh2). Представлено статистичний аналіз трьох біологічно незалежних зразків у кожній групі. i Гліколітичну активність клітин A549 до та після нокдауну SLC7A5 вимірювали за допомогою швидкості позаклітинного закислення (ECAR) (n = 4 біологічно незалежні зразки на групу). 2-DG,2-дезокси-D-глюкоза. У (b–h) використовували двосторонній t-критерій Стьюдента. У (g–i) смужки похибок представляють середнє значення ± SD, кожен експеримент проводили тричі незалежно, і результати були подібними. Вихідні дані надаються у вигляді файлів вихідних даних.
Враховуючи значний вплив зміненого метаболізму триптофану в групі LA, ми також оцінили рівні триптофану в сироватці крові в групах HC, BN та LA за допомогою QQQ. Ми виявили, що рівень триптофану в сироватці крові був знижений у LA порівняно з HC або BN (p < 0,001, Рисунок 5d), що узгоджується з попередніми висновками про те, що рівень триптофану в крові нижчий у пацієнтів з раком легенів, ніж у здорових людей контрольної групи33,34,35. Інше дослідження з використанням ПЕТ/КТ-індикатора 11C-метил-L-триптофану виявило, що час утримання сигналу триптофану в тканині раку легенів був значно збільшений порівняно з доброякісними ураженнями або нормальною тканиною36. Ми висуваємо гіпотезу, що зниження рівня триптофану в сироватці крові LA може відображати активне поглинання триптофану клітинами раку легенів.
Також відомо, що кінцевим продуктом кінуренінового шляху катаболізму триптофану є NAD+37,38, який є важливим субстратом для реакції гліцеральдегід-3-фосфату з 1,3-бісфосфогліцератом у гліколізі39. Хоча попередні дослідження зосереджувалися на ролі катаболізму триптофану в імунній регуляції, ми прагнули з'ясувати взаємодію між дисрегуляцією триптофану та гліколітичними шляхами, що спостерігається в цьому дослідженні. Відомо, що член 5 родини транспортерів розчинених речовин 7 (SLC7A5) є транспортером триптофану43,44,45. Хінолінова кислота фосфорибозилтрансфераза (QPRT) - це фермент, розташований нижче за течією від кінуренінового шляху, який перетворює хінолінову кислоту на NAMN46. Аналіз набору даних LUAD TCGA показав, що як SLC7A5, так і QPRT були значно підвищені в пухлинній тканині порівняно з нормальною тканиною (рис. 5e). Це збільшення спостерігалося на стадіях I та II, а також на стадіях III та IV аденокарциноми легень (Додатковий рисунок 11), що вказує на ранні порушення метаболізму триптофану, пов'язані з онкогенезом.
Крім того, набір даних LUAD-TCGA показав позитивну кореляцію між експресією мРНК SLC7A5 та GAPDH у зразках пацієнтів з раком (r = 0,45, p = 1,55E-26, Рисунок 5f). Натомість, значної кореляції між такими генними сигнатурами в нормальній тканині легень не було виявлено (r = 0,25, p = 0,06, Рисунок 5f). Нокдаун SLC7A5 (Додатковий Рисунок 12) у клітинах A549 значно знизив рівні триптофану та NAD(H) у клітинах (Рисунок 5g,h), що призвело до ослабленої гліколітичної активності, виміряної за допомогою швидкості позаклітинного підкислення (ECAR) (Рисунок 1). 5i). Таким чином, на основі метаболічних змін у сироватці крові та виявлення in vitro, ми висуваємо гіпотезу, що метаболізм триптофану може утворювати NAD+ через кінуреніновий шлях та відігравати важливу роль у сприянні гліколізу при раку легень.
Дослідження показали, що велика кількість невизначених легеневих вузликів, виявлених за допомогою КТ, може призвести до необхідності додаткового обстеження, такого як ПЕТ-КТ, біопсія легень та надмірне лікування через хибнопозитивний діагноз злоякісного новоутворення.31 Як показано на рисунку 6, наше дослідження визначило панель сироваткових метаболітів з потенційною діагностичною цінністю, що може покращити стратифікацію ризику та подальше лікування легеневих вузликів, виявлених за допомогою КТ.
Легеневі вузлики оцінюються за допомогою низькодозової комп'ютерної томографії (ЛКТ) з ознаками візуалізації, що вказують на доброякісні або злоякісні причини. Невизначений результат лікування вузликів може призвести до частих візитів до спостереження, непотрібних втручань та надмірного лікування. Включення класифікаторів сироваткового метаболізму з діагностичною цінністю може покращити оцінку ризику та подальше лікування легеневих вузликів. ПЕТ-позитронно-емісійна томографія.
Дані дослідження NLST у США та європейського дослідження NELSON свідчать про те, що скринінг груп високого ризику за допомогою низькодозової комп'ютерної томографії (LDCT) може знизити смертність від раку легень1,3. Однак оцінка ризику та подальше клінічне ведення великої кількості випадково виявлених легеневих вузликів за допомогою LDCT залишаються найскладнішими. Головною метою є оптимізація правильної класифікації існуючих протоколів на основі LDCT шляхом включення надійних біомаркерів.
Певні молекулярні біомаркери, такі як метаболіти крові, були ідентифіковані шляхом порівняння раку легенів зі здоровими людьми контрольної групи15,17. У цьому дослідженні ми зосередилися на застосуванні аналізу метаболоміки сироватки крові для розрізнення доброякісних та злоякісних легеневих вузликів, випадково виявлених за допомогою LDCT. Ми порівняли глобальний метаболом сироватки крові зразків здорового контролю (HC), доброякісних легеневих вузликів (BN) та аденокарциноми легень (LA) I стадії за допомогою аналізу UPLC-HRMS. Ми виявили, що HC та BN мали подібні метаболічні профілі, тоді як LA показала значні зміни порівняно з HC та BN. Ми визначили два набори метаболітів сироватки крові, які відрізняють LA від HC та BN.
Поточна схема ідентифікації доброякісних та злоякісних вузликів на основі LDCT головним чином базується на розмірі, щільності, морфології та швидкості росту вузликів з часом30. Попередні дослідження показали, що розмір вузликів тісно пов'язаний з ймовірністю раку легень. Навіть у пацієнтів з високим ризиком ризик злоякісного новоутворення у вузлах <6 мм становить <1%. Ризик злоякісного новоутворення для вузликів розміром від 6 до 20 мм коливається від 8% до 64%30. Тому Товариство Флейшнера рекомендує граничний діаметр 6 мм для рутинного КТ-спостереження.29 Однак оцінка ризику та лікування невизначених легеневих вузликів (НВЛ) розміром понад 6 мм не проводилися належним чином31. Сучасне лікування вроджених вад серця зазвичай базується на пильному очікуванні з частим КТ-моніторингом.
На основі валідованого метаболому ми вперше продемонстрували перекриття метаболомних сигнатур між здоровими особами та доброякісними вузликами <6 мм. Біологічна подібність узгоджується з попередніми результатами КТ, які показали, що ризик злоякісності вузликів <6 мм такий же низький, як і для осіб без вузлів.30 Слід зазначити, що наші результати також демонструють, що доброякісні вузлики <6 мм та ≥6 мм мають високу подібність у метаболомних профілях, що свідчить про те, що функціональне визначення доброякісної етіології є послідовним незалежно від розміру вузликів. Таким чином, сучасні діагностичні панелі метаболітів сироватки можуть забезпечити єдиний аналіз як тест виключення, коли вузлики вперше виявляються на КТ, і потенційно зменшити серійний моніторинг. Водночас, та сама панель метаболічних біомаркерів розрізняла злоякісні вузлики розміром ≥6 мм від доброякісних вузликів і надавала точні прогнози для внутрішньовузлових легеневих вузликів подібного розміру та неоднозначних морфологічних ознак на КТ-зображеннях. Цей класифікатор метаболізму сироватки добре показав себе в прогнозуванні злоякісності вузликів ≥6 мм з AUC 0,927. Узяті разом, наші результати показують, що унікальні сироваткові метаболомні сигнатури можуть специфічно відображати ранні метаболічні зміни, викликані пухлиною, та мати потенційну цінність як предиктори ризику, незалежно від розміру вузликів.
Примітно, що аденокарцинома легень (LUAD) та плоскоклітинний рак (LUSC) є основними типами недрібноклітинного раку легень (НДРЛ). Враховуючи, що LUSC тісно пов'язаний зі вживанням тютюну47, а LUAD є найпоширенішою гістологією випадкових вузликів легень, виявлених під час КТ-скринінгу48, наша модель класифікатора була спеціально створена для зразків аденокарциноми I стадії. Ван та його колеги також зосередилися на LUAD та визначили дев'ять ліпідних сигнатур за допомогою ліпідоміки для відрізнення раку легень на ранній стадії від здорових осіб17. Ми протестували поточну модель класифікатора на 16 випадках LUSC I стадії та 74 доброякісних вузликах і спостерігали низьку точність прогнозування LUSC (AUC 0,776), що свідчить про те, що LUAD та LUSC можуть мати власні метаболомні сигнатури. Дійсно, було показано, що LUAD та LUSC відрізняються за етіологією, біологічним походженням та генетичними абераціями49. Тому інші типи гістології повинні бути включені до навчальних моделей для популяційного виявлення раку легень у програмах скринінгу.
Тут ми визначили шість найчастіше змінених шляхів при аденокарциномі легень порівняно зі здоровими людьми контрольної групи та доброякісними вузликами. Ксантин та гіпоксантин є поширеними метаболітами пуринового метаболічного шляху. Відповідно до наших результатів, проміжні продукти, пов'язані з метаболізмом пуринів, були значно підвищені в сироватці крові або тканинах пацієнтів з аденокарциномою легень порівняно зі здоровими людьми контрольної групи або пацієнтами на преінвазивній стадії15,50. Підвищені рівні ксантину та гіпоксантину в сироватці крові можуть відображати анаболізм, необхідний для швидко проліферуючих ракових клітин. Порушення регуляції метаболізму глюкози є добре відомою ознакою метаболізму раку51. Тут ми спостерігали значне збільшення пірувату та лактату в групі LA порівняно з групою HC та BN, що узгоджується з попередніми повідомленнями про порушення гліколітичних шляхів у профілях метаболому сироватки крові пацієнтів з недрібноклітинним раком легень (НДРЛ) та здорових людей контрольної групи. Результати є узгодженими52,53.
Важливо, що ми спостерігали зворотну кореляцію між метаболізмом пірувату та триптофану в сироватці крові пацієнтів з аденокарциномою легень. Рівень триптофану в сироватці крові був знижений у групі LA порівняно з групою HC або BN. Цікаво, що попереднє великомасштабне дослідження з використанням проспективної когортної групи виявило, що низький рівень циркулюючого триптофану пов'язаний з підвищеним ризиком раку легень 54. Триптофан – це незамінна амінокислота, яку ми повністю отримуємо з їжі. Ми робимо висновок, що виснаження триптофану в сироватці крові при аденокарциномі легень може відображати швидке виснаження цього метаболіту. Загальновідомо, що кінцевий продукт катаболізму триптофану через кінуреніновий шлях є джерелом de novo синтезу NAD+. Оскільки NAD+ виробляється переважно через шлях утилізації, важливість NAD+ у метаболізмі триптофану в здоров'ї та при захворюваннях залишається нез'ясованою 46. Наш аналіз бази даних TCGA показав, що експресія транспортера розчинених речовин триптофану 7A5 (SLC7A5) була значно підвищена в аденокарциномі легень порівняно з нормальним контролем і позитивно корелювала з експресією гліколітичного ферменту GAPDH. Попередні дослідження в основному зосереджувалися на ролі катаболізму триптофану в пригніченні протипухлинної імунної відповіді40,41,42. Тут ми демонструємо, що пригнічення поглинання триптофану шляхом нокдауну SLC7A5 у клітинах раку легень призводить до подальшого зниження рівня NAD у клітинах та супутнього ослаблення гліколітичної активності. Підсумовуючи, наше дослідження забезпечує біологічну основу для змін у метаболізмі сироватки крові, пов'язаних зі злоякісною трансформацією аденокарциноми легень.
Мутації EGFR є найпоширенішими драйверними мутаціями у пацієнтів з НМРЛ. У нашому дослідженні ми виявили, що пацієнти з мутацією EGFR (n = 41) мали загальні метаболомічні профілі, подібні до пацієнтів з EGFR дикого типу (n = 31), хоча ми виявили знижені рівні EGFR у сироватці крові деяких пацієнтів з мутацією EGFR у пацієнтів, які приймали ацилкарнітин. Встановлена функція ацилкарнітинів полягає в транспортуванні ацильних груп з цитоплазми в мітохондріальний матрикс, що призводить до окислення жирних кислот для виробництва енергії 55. Відповідно до наших висновків, нещодавнє дослідження також виявило подібні профілі метаболому між пухлинами з мутацією EGFR та диким типом EGFR шляхом аналізу глобального метаболому 102 зразків тканини аденокарциноми легень 50. Цікаво, що вміст ацилкарнітину також був виявлений у групі з мутацією EGFR. Тому питання про те, чи відображають зміни рівнів ацилкарнітину індуковані EGFR метаболічні зміни та основні молекулярні шляхи, може потребувати подальшого вивчення.
На завершення, наше дослідження встановлює класифікатор метаболізму сироватки крові для диференціальної діагностики легеневих вузликів та пропонує робочий процес, який може оптимізувати оцінку ризику та полегшити клінічне ведення пацієнтів на основі скринінгу за допомогою комп'ютерної томографії.
Це дослідження було схвалено Етичним комітетом Онкологічної лікарні Університету Сунь Ятсена, Першою афілійованою лікарнею Університету Сунь Ятсена та Етичним комітетом Онкологічної лікарні Університету Чженчжоу. У групах виявлення та внутрішньої валідації було зібрано 174 сироватки крові від здорових осіб та 244 сироватки крові від доброякісних вузликів від осіб, які проходили щорічні медичні огляди у відділі контролю та профілактики раку Онкологічного центру Університету Сунь Ятсена, а також 166 сироваток крові від доброякісних вузликів. Аденокарциноми легень I стадії були зібрані з Онкологічного центру Університету Сунь Ятсена. У когорті зовнішньої валідації було 48 випадків доброякісних вузликів, 39 випадків аденокарциноми легень I стадії з Першої афілійованої лікарні Університету Сунь Ятсена та 24 випадки аденокарциноми легень I стадії з Онкологічної лікарні Чженчжоу. Онкологічний центр Університету Сунь Ятсена також зібрав 16 випадків плоскоклітинного раку легень I стадії для перевірки діагностичної здатності встановленого метаболічного класифікатора (характеристики пацієнтів наведено в Додатковій таблиці 5). Зразки з когорти виявлення та когорти внутрішньої валідації були зібрані з січня 2018 року по травень 2020 року. Зразки для когорти зовнішньої валідації були зібрані з серпня 2021 року по жовтень 2022 року. Щоб мінімізувати гендерну упередженість, до кожної когорті було розподілено приблизно однакову кількість випадків чоловічої та жіночої статі. Команда виявлення та команда внутрішнього огляду. Стать учасників визначалася на основі самозвіту. Від усіх учасників було отримано інформовану згоду, і компенсація не надавалася. Суб'єктами з доброякісними вузликами були ті, хто мав стабільний бал КТ через 2-5 років на момент аналізу, за винятком 1 випадку із вибірки зовнішньої валідації, який був зібраний до операції та діагностований гістопатологічним дослідженням. За винятком хронічного бронхіту. Випадки аденокарциноми легень були зібрані до резекції легень та підтверджені патологоанатомічним діагнозом. Зразки крові натщесерце збирали в пробірки для розділення сироватки без будь-яких антикоагулянтів. Зразки крові згортали протягом 1 години при кімнатній температурі, а потім центрифугували при 2851 × g протягом 10 хвилин при 4°C для збору супернатанту сироватки. Аліквоти сироватки заморожували при температурі -80°C до екстракції метаболітів. Відділ профілактики раку та медичного обстеження Онкологічного центру Університету Сунь Ятсена зібрав пул сироваток від 100 здорових донорів, включаючи рівну кількість чоловіків та жінок віком від 40 до 55 років. Рівні об'єми кожного зразка донора змішували, отриманий пул розділяли на аліквоти та зберігали при температурі -80°C. Сироваткову суміш використовували як референтний матеріал для контролю якості та стандартизації даних.
Еталонну сироватку та тестові зразки розморожували, а метаболіти екстрагували за допомогою методу комбінованої екстракції (МТБЕ/метанол/вода) 56. Коротко кажучи, 50 мкл сироватки змішували з 225 мкл крижаного метанолу та 750 мкл крижаного метил-трет-бутилового ефіру (МТБЕ). Перемішували суміш та інкубували на льоду протягом 1 години. Потім зразки змішували та змішували на вортексі з 188 мкл води MS-класу, що містить внутрішні стандарти (13C-лактат, 13C3-піруват, 13C-метіонін та 13C6-ізолейцин, придбані в Cambridge Isotope Laboratories). Потім суміш центрифугували при 15 000 × g протягом 10 хвилин при 4 °C, а нижню фазу переносили у дві пробірки (по 125 мкл кожна) для аналізу LC-MS у позитивному та негативному режимах. Нарешті, зразок випарювали насухо у високошвидкісному вакуумному концентраторі.
Висушені метаболіти відновлювали у 120 мкл 80% ацетонітрилу, перемішували на вортексі протягом 5 хвилин та центрифугували при 15 000 × g протягом 10 хвилин при 4°C. Супернатанти переносили у флакони з бурштинового скла з мікровставками для метаболомних досліджень. Нецільовий метаболомний аналіз проводили на платформі ультрапродуктивної рідинної хроматографії з високою роздільною здатністю (UPLC-HRMS). Метаболіти розділяли за допомогою системи Dionex Ultimate 3000 UPLC та колонки ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 мм, 1,7 мкм, Waters). У режимі позитивних іонів рухомі фази складали 95% (A) та 50% ацетонітрилу (B), кожна з яких містила 10 ммоль/л ацетату амонію та 0,1% мурашиної кислоти. У негативному режимі рухомі фази A та B містили 95% та 50% ацетонітрилу відповідно, обидві фази містили 10 ммоль/л ацетату амонію, pH = 9. Градієнтна програма була наступною: 0–0,5 хв, 2% B; 0,5–12 хв, 2–50% B; 12–14 хв, 50–98% B; 14–16 хв, 98% B; 16–16,1 хв, 98–2% B; 16,1–20 хв, 2% B. Колонку підтримували при 40°C, а зразок – при 10°C в автосамплері. Швидкість потоку становила 0,3 мл/хв, об'єм введення – 3 мкл. Мас-спектрометр Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) з джерелом електророзпилювальної іонізації (ESI) працював у режимі повного сканування та поєднувався з режимом моніторингу ddMS2 для збору великих обсягів даних. Параметри МС були встановлені наступним чином: напруга розпилення +3,8 кВ/- 3,2 кВ, температура капіляра 320°C, захисний газ 40 arb, допоміжний газ 10 arb, температура нагрівача зонда 350°C, діапазон сканування 70–1050 м/год, роздільна здатність 70 000. Дані були отримані за допомогою Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Для оцінки якості даних були отримані об'єднані зразки контролю якості (КЯ) шляхом відбору аліквот супернатанту об'ємом 10 мкл з кожного зразка. Шість ін'єкцій зразків контролю якості були проаналізовані на початку аналітичної послідовності для оцінки стабільності системи UPLC-MS. Потім зразки контролю якості періодично вводяться в партію. Всі 11 партій зразків сироватки в цьому дослідженні були проаналізовані за допомогою LC-MS. Аліквоти суміші пулу сироватки від 100 здорових донорів використовувалися як референтний матеріал у відповідних партіях для моніторингу процесу екстракції та коригування впливу від партії до партії. Нецільовий метаболомічний аналіз когорти виявлення, когорти внутрішньої валідації та когорти зовнішньої валідації був проведений у Центрі метаболоміки Університету Сунь Ятсена. Зовнішня лабораторія Центру аналізу та випробувань Технологічного університету Гуандуна також проаналізувала 40 зразків із зовнішньої когорти для перевірки ефективності моделі класифікатора.
Після екстракції та відновлення абсолютну кількісну кількість метаболітів у сироватці крові вимірювали за допомогою надвисокоефективної рідинної хроматографії-тандемної мас-спектрометрії (потрійний квадруполь Agilent 6495) з джерелом електророзпилювальної іонізації (ESI) у режимі багаторазового моніторингу реакцій (MRM). Для розділення метаболітів використовували колонку ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 мм, 1,7 мкм, Waters). Рухома фаза складалася з 90% (A) та 5% ацетонітрилу (B) з 10 ммоль/л ацетату амонію та 0,1% розчину аміаку. Градієнтна програма була наступною: 0–1,5 хв, 0% B; 1,5–6,5 хв, 0–15% B; 6,5–8 хв, 15% B; 8–8,5 хв, 15%–0% B; 8,5–11,5 хв, 0% B. Колонку підтримували при температурі 40 °C, а зразок – при 10 °C в автосамплері. Швидкість потоку становила 0,3 мл/хв, а об'єм ін'єкції – 1 мкл. Параметри МС були встановлені наступним чином: напруга на капілярі ±3,5 кВ, тиск у небулайзері 35 фунтів на квадратний дюйм, потік газу оболонки 12 л/хв, температура газу оболонки 350 °C, температура сушильного газу 250 °C та потік сушильного газу 14 л/хв. Конверсії MRM триптофану, пірувату, лактату, гіпоксантину та ксантину становили 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 та 151,0–107,9 відповідно. Дані були зібрані за допомогою Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Для зразків сироватки триптофан, піруват, лактат, гіпоксантин та ксантин кількісно визначали за допомогою калібрувальних кривих стандартних сумішей розчинів. Для зразків клітин вміст триптофану нормалізували відносно внутрішнього стандарту та маси клітинного білка.
Екстракцію піків (m/z та час утримування (RT)) проводили за допомогою Compound Discovery 3.1 та TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Щоб усунути потенційні відмінності між партіями, кожен характеристичний пік тестового зразка ділили на характеристичний пік еталонного матеріалу з тієї ж партії для отримання відносної кількості. Відносні стандартні відхилення внутрішніх стандартів до та після стандартизації наведено в Додатковій таблиці 6. Різниця між двома групами характеризувалася частотою хибних відкриттів (FDR<0,05, критерій знакових рангів Вілкоксона) та кратністю зміни (>1,2 або <0,83). Необроблені дані мас-спектрометрії (MS) екстрагованих ознак та дані мас-спектрометрії, скориговані за еталонною сироваткою, наведено в Додаткових даних 1 та Додаткових даних 2 відповідно. Анотацію піків проводили на основі чотирьох визначених рівнів ідентифікації, включаючи ідентифіковані метаболіти, ймовірно анотовані сполуки, ймовірно охарактеризовані класи сполук та невідомі сполуки 22. На основі пошуку в базі даних Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) біологічні сполуки з валідованими стандартами, що відповідають MS/MS, або анотаціями точної відповідності в mzCloud (оцінка > 85) або Chemspider, були остаточно обрані як проміжні продукти між диференціальним метаболомом. Анотації піків для кожної ознаки включено до Додаткових даних 3. MetaboAnalyst 5.0 використовувався для однофакторного аналізу сумарно нормалізованої кількості метаболітів. MetaboAnalyst 5.0 також оцінював аналіз збагачення шляху KEGG на основі суттєво різних метаболітів. Аналіз головних компонентів (PCA) та дискримінантний аналіз часткових найменших квадратів (PLS-DA) аналізували за допомогою програмного пакета ropls (версія 1.26.4) з нормалізацією стеку та автоматичним масштабуванням. Оптимальна модель біомаркерів метаболітів для прогнозування злоякісності вузликів була створена за допомогою бінарної логістичної регресії з найменшим абсолютним зменшенням та оператором відбору (LASSO, пакет R версії 4.1-3). Продуктивність дискримінантної моделі в наборах для виявлення та валідації характеризували шляхом оцінки AUC на основі ROC-аналізу згідно з пакетом pROC (версія 1.18.0). Оптимальне порогове значення ймовірності було отримано на основі максимального індексу Юдена моделі (чутливість + специфічність – 1). Зразки зі значеннями меншими або більшими за поріг будуть прогнозовані як доброякісні вузлики та аденокарцинома легень відповідно.
Клітини A549 (#CCL-185, Американська колекція типових культур) вирощували у середовищі F-12K, що містило 10% FBS. Послідовності коротких шпилькових РНК (shRNA), спрямовані на SLC7A5, та нецільовий контроль (NC), були вставлені в лентивірусний вектор pLKO.1-puro. Антисенсові послідовності shSLC7A5 такі: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Антитіла до SLC7A5 (#5347) та тубуліну (#2148) були придбані у Cell Signaling Technology. Антитіла до SLC7A5 та тубуліну використовували у розведенні 1:1000 для вестерн-блот аналізу.
Гліколітичний стрес-тест Seahorse XF вимірює рівні позаклітинного закислення (ECAR). У дослідженні глюкозу, олігоміцин А та 2-DG вводили послідовно для перевірки гліколітичної здатності клітин, виміряної за допомогою ECAR.
Клітини A549, трансфіковані нецільовим контролем (NC) та shSLC7A5 (Sh1, Sh2), висівали на ніч у чашки діаметром 10 см. Клітинні метаболіти екстрагували 1 мл крижаного 80% водного розчину метанолу. Клітини в метанольному розчині зішкрібали, збирали в нову пробірку та центрифугували при 15 000 × g протягом 15 хвилин при 4°C. Збирали 800 мкл супернатанту та сушили за допомогою високошвидкісного вакуумного концентратора. Висушені гранули метаболітів потім аналізували на рівень триптофану за допомогою LC-MS/MS, як описано вище. Клітинні рівні NAD(H) у клітинах A549 (NC та shSLC7A5) вимірювали за допомогою кількісного колориметричного набору NAD+/NADH (#K337, BioVision) згідно з інструкціями виробника. Рівні білка вимірювали для кожного зразка для нормалізації кількості метаболітів.
Для попереднього визначення розміру вибірки не використовувалися статистичні методи. Попередні метаболомічні дослідження, спрямовані на виявлення біомаркерів15,18, розглядалися як контрольні показники для визначення розміру, і порівняно з цими звітами наша вибірка була адекватною. Жоден зразок не був виключений з когорти дослідження. Зразки сироватки були випадковим чином розподілені на групу виявлення (306 випадків, 74,6%) та групу внутрішньої валідації (104 випадки, 25,4%) для нецільових метаболомічних досліджень. Ми також випадковим чином відібрали 70 випадків з кожної групи з набору виявлення для цільових метаболомічних досліджень. Дослідники не знали розподілу за групами під час збору та аналізу даних LC-MS. Статистичний аналіз даних метаболоміки та клітинних експериментів описано у відповідних розділах «Результати», «Позначення рисунків» та «Методи». Кількісне визначення клітинного триптофану, NADT та гліколітичної активності проводилося тричі незалежно з ідентичними результатами.
Для отримання додаткової інформації про дизайн дослідження див. анотацію звіту про природний портфель, пов’язану з цією статтею.
Необроблені дані мас-спектрометрії (MS) витягнутих ознак та нормалізовані дані мас-спектрометрії еталонної сироватки наведено відповідно у Додаткових даних 1 та Додаткових даних 2. Анотації піків для диференціальних ознак представлені у Додаткових даних 3. Набір даних LUAD TCGA можна завантажити з https://portal.gdc.cancer.gov/. Вхідні дані для побудови графіка наведено у вихідних даних. Вихідні дані наведено для цієї статті.
Національна дослідницька група зі скринінгу легень та ін. Зниження смертності від раку легень за допомогою низькодозової комп'ютерної томографії. Північна Англія. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Крамер, Б.С., Берг, К.Д., Аберле, Д.Р. та Профет, П.К. Скринінг раку легень за допомогою низькодозової спіральної КТ: результати Національного дослідження скринінгу легень (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
Де Конінг, Х. Дж. та ін. Зниження смертності від раку легень за допомогою волюметричного КТ-скринінгу в рандомізованому дослідженні. Північна Англія. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Час публікації: 18 вересня 2023 р.