Диференціальна діагностика легеневих вузлів, виявлених за допомогою комп’ютерної томографії (КТ), залишається проблемою в клінічній практиці.Тут ми характеризуємо глобальний метаболом 480 зразків сироватки, включно зі здоровими контрольними особами, доброякісними вузликами в легенях і аденокарциномою легенів I стадії.Аденокарциноми демонструють унікальні метаболомічні профілі, тоді як доброякісні вузли та здорові люди мають високу схожість у метаболомічних профілях.У групі відкриття (n = 306) було ідентифіковано набір із 27 метаболітів для диференціації доброякісних і злоякісних вузликів.AUC дискримінантної моделі в групах внутрішньої перевірки (n = 104) і зовнішньої перевірки (n = 111) становила 0,915 і 0,945 відповідно.Аналіз шляху виявив збільшення гліколітичних метаболітів, пов’язаних зі зниженням триптофану в сироватці аденокарциноми легенів порівняно з доброякісними вузликами та здоровими особами з контролю, і припустив, що поглинання триптофану сприяє гліколізу в клітинах раку легенів.Наше дослідження підкреслює цінність біомаркерів сироваткових метаболітів для оцінки ризику легеневих вузликів, виявлених за допомогою КТ.
Рання діагностика має вирішальне значення для підвищення рівня виживаності хворих на рак.Результати Національного дослідження раку легенів у США (NLST) і європейського дослідження NELSON показали, що скринінг за допомогою низькодозової комп’ютерної томографії (LDCT) може значно знизити смертність від раку легенів у групах високого ризику1,2,3.З моменту широкого використання LDCT для скринінгу раку легенів частота випадкових рентгенологічних знахідок безсимптомних легеневих вузликів продовжує зростати 4 .Легеневі вузлики визначаються як вогнищеві помутніння діаметром до 3 см 5 .Ми стикаємося з труднощами в оцінці ймовірності злоякісності та роботі з великою кількістю легеневих вузликів, випадково виявлених на LDCT.Обмеження КТ можуть призвести до частих контрольних обстежень і хибнопозитивних результатів, що призведе до непотрібного втручання та надмірного лікування6.Тому існує потреба в розробці надійних і корисних біомаркерів для правильної ідентифікації раку легенів на ранніх стадіях і диференціації більшості доброякісних вузликів при первинному виявленні 7 .
Комплексний молекулярний аналіз крові (сироватки, плазми, мононуклеарних клітин периферичної крові), включаючи геноміку, протеоміку або метилювання ДНК8,9,10, призвів до зростання інтересу до відкриття діагностичних біомаркерів раку легенів.Тим часом метаболомічні підходи вимірюють клітинні кінцеві продукти, на які впливають ендогенні та екзогенні дії, і тому застосовуються для прогнозування початку та результату захворювання.Рідинна хроматографія-тандемна мас-спектрометрія (РХ-МС) є широко використовуваним методом метаболомічних досліджень завдяки своїй високій чутливості та широкому динамічному діапазону, який може охоплювати метаболіти з різними фізико-хімічними властивостями11,12,13.Хоча глобальний метаболомічний аналіз плазми/сироватки був використаний для ідентифікації біомаркерів, пов’язаних з діагностикою раку легенів14,15,16,17 та ефективністю лікування,18 класифікатори сироваткових метаболітів для розрізнення доброякісних і злоякісних легеневих вузликів ще потребують значного вивчення.- масове дослідження.
Аденокарцинома та плоскоклітинний рак є двома основними підтипами недрібноклітинного раку легенів (НДРЛ).Різні КТ скринінгові тести показують, що аденокарцинома є найпоширенішим гістологічним типом раку легенів1,19,20,21.У цьому дослідженні ми використовували ультраефективну рідинну хроматографію з мас-спектрометрією високої роздільної здатності (UPLC-HRMS) для проведення метаболомічного аналізу загалом 695 зразків сироватки, включаючи здорові контрольні, доброякісні легеневі вузлики та КТ-виявлені ≤3 см.Скринінг на аденокарциному легені I стадії.Ми ідентифікували групу сироваткових метаболітів, які відрізняють аденокарциному легенів від доброякісних вузликів і здорових контрольних пацієнтів.Аналіз збагачення шляхів виявив, що аномальний метаболізм триптофану та глюкози є загальними змінами при аденокарциномі легенів порівняно з доброякісними вузликами та здоровими особами контролю.Нарешті, ми створили та підтвердили метаболічний класифікатор сироватки з високою специфічністю та чутливістю для розрізнення злоякісних і доброякісних легеневих вузлів, виявлених за допомогою LDCT, що може допомогти в ранній диференціальній діагностиці та оцінці ризику.
У поточному дослідженні зразки сироватки відповідної статі та віку були ретроспективно зібрані у 174 здорових осіб із контролю, 292 пацієнтів із доброякісними легеневими вузликами та 229 пацієнтів із стадією аденокарциноми легені.Демографічні характеристики 695 суб’єктів наведено в додатковій таблиці 1.
Як показано на малюнку 1а, загалом 480 зразків сироватки, включаючи 174 зразки здорового контролю (HC), 170 доброякісних вузликів (BN) і 136 зразків аденокарциноми легені (LA) I стадії, було зібрано в онкологічному центрі університету Сунь Ятсена.Когорта виявлення для нецільового метаболомічного профілювання за допомогою ультраефективної рідинної хроматографії з мас-спектрометрією високої роздільної здатності (UPLC-HRMS).Як показано на Додатковому малюнку 1, диференціальні метаболіти між LA та HC, LA та BN були ідентифіковані для встановлення моделі класифікації та подальшого вивчення диференційного аналізу шляху.104 зразки, зібрані Онкологічним центром Університету Сунь Ятсена, і 111 зразків, зібрані двома іншими лікарнями, пройшли внутрішню та зовнішню перевірку відповідно.
Досліджувана популяція в досліджуваній когорті, яка пройшла глобальний метаболомічний аналіз сироватки крові за допомогою ультраефективної рідинної хроматографії з мас-спектрометрією високої роздільної здатності (UPLC-HRMS).b Дискримінантний аналіз часткових найменших квадратів (PLS-DA) загального метаболома 480 зразків сироватки з когорти дослідження, включаючи здорових осіб контролю (HC, n = 174), доброякісні вузлики (BN, n = 170) і стадію I аденокарциноми легені (Лос-Анджелес, n = 136).+ESI, режим позитивної іонізації електророзпиленням, -ESI, режим негативної іонізації електророзпиленням.c–e Метаболіти зі значною різницею в кількості у двох заданих групах (двобічний тест Вілкоксона зі знаком рангів, значення p з поправкою на частоту помилкових відкриттів, FDR <0,05) показані червоним (кратна зміна > 1,2) і синім (кратна зміна < 0,83) .), показано на графіку вулкана.f Теплова карта ієрархічної кластеризації, яка показує значні відмінності в кількості анотованих метаболітів між LA та BN.Вихідні дані надаються у формі файлів вихідних даних.
Загальний метаболом сироватки 174 HC, 170 BN і 136 LA у групі відкриття аналізували за допомогою аналізу UPLC-HRMS.Спочатку ми показуємо, що зразки контролю якості (КЯ) щільно згруповані в центрі моделі неконтрольованого аналізу головних компонентів (PCA), підтверджуючи стабільність показників поточного дослідження (додатковий малюнок 2).
Як показано в дискримінантному аналізі часткових найменших квадратів (PLS-DA) на малюнку 1b, ми виявили чіткі відмінності між LA та BN, LA та HC у позитивному (+ESI) та негативному (−ESI) режимах іонізації електророзпиленням. .ізольований.Однак суттєвих відмінностей між BN і HC в умовах +ESI і -ESI не виявлено.
Ми знайшли 382 диференціальні ознаки між LA та HC, 231 диференціальну ознаку між LA та BN та 95 диференційних ознак між BN та HC (тест Вілкоксона за знаковим рангом, FDR <0,05 та множинні зміни >1,2 або <0,83) (Рис. .1c-e )..Піки були додатково анотовані (додаткові дані 3) у базі даних (бібліотека mzCloud/HMDB/Chemspider) за значенням m/z, часом утримування та пошуком мас-спектру фрагментації (подробиці описано в розділі «Методи») 22.Нарешті, 33 і 38 анотованих метаболітів зі значними відмінностями в кількості були ідентифіковані для LA проти BN (рис. 1f і додаткова таблиця 2) і LA проти HC (додаткова рис. 3 і додаткова таблиця 2), відповідно.Навпаки, лише 3 метаболіти зі значними відмінностями в кількості були ідентифіковані в BN і HC (додаткова таблиця 2), що відповідає перекриттю між BN і HC у PLS-DA.Ці диференціальні метаболіти охоплюють широкий спектр біохімічних речовин (додатковий малюнок 4).У сукупності ці результати демонструють значні зміни в метаболомі сироватки, які відображають злоякісну трансформацію раку легенів на ранній стадії порівняно з доброякісними вузликами легенів або здоровими суб’єктами.Тим часом подібність сироваткового метаболому BN і HC свідчить про те, що доброякісні легеневі вузлики можуть мати багато спільних біологічних характеристик зі здоровими людьми.З огляду на те, що мутації гена рецептора епідермального фактора росту (EGFR) є поширеними при аденокарциномі легенів підтипу 23, ми намагалися визначити вплив мутацій драйвера на метаболом сироватки.Потім ми проаналізували загальний метаболомічний профіль 72 випадків із статусом EGFR у групі аденокарциноми легенів.Цікаво, що ми знайшли порівняльні профілі між пацієнтами з мутантами EGFR (n = 41) і пацієнтами з EGFR дикого типу (n = 31) в аналізі PCA (додатковий малюнок 5a).Проте ми ідентифікували 7 метаболітів, кількість яких була значно змінена у пацієнтів з мутацією EGFR порівняно з пацієнтами з EGFR дикого типу (t-тест, p < 0,05 і кратність > 1,2 або < 0,83) (додатковий малюнок 5b).Більшість цих метаболітів (5 із 7) є ацилкарнітинами, які відіграють важливу роль у шляхах окислення жирних кислот.
Як показано в робочому процесі, показаному на малюнку 2а, біомаркери для класифікації вузликів були отримані з використанням операторів найменшого абсолютного скорочення та відбору на основі 33 диференціальних метаболітів, ідентифікованих у LA (n = 136) і BN (n = 170).Найкраща комбінація змінних (LASSO) – модель бінарної логістичної регресії.Десятикратна перехресна перевірка була використана для перевірки надійності моделі.Вибір змінних і регулярізація параметрів коригуються штрафом за максимізацію ймовірності з параметром λ24.Глобальний метаболомічний аналіз далі проводився незалежно в групах внутрішньої перевірки (n = 104) і зовнішньої перевірки (n = 111), щоб перевірити ефективність класифікації дискримінантної моделі.У результаті 27 метаболітів у наборі виявлення були ідентифіковані як найкраща дискримінантна модель з найбільшим середнім значенням AUC (рис. 2b), серед яких 9 мали підвищену активність і 18 знижену активність у LA порівняно з BN (рис. 2c).
Робочий процес для побудови класифікатора легеневих вузликів, включаючи вибір найкращої панелі сироваткових метаболітів у наборі для виявлення за допомогою моделі бінарної логістичної регресії через десятикратну перехресну перевірку та оцінку ефективності прогнозування у наборах внутрішньої та зовнішньої перевірки.b Статистика перехресної перевірки регресійної моделі LASSO для вибору метаболічного біомаркера.Числа, наведені вище, представляють середню кількість біомаркерів, відібраних при заданому λ.Червона пунктирна лінія представляє середнє значення AUC при відповідному лямбда.Сірі смуги помилок представляють мінімальне та максимальне значення AUC.Пунктирна лінія вказує на найкращу модель із 27 вибраними біомаркерами.AUC, площа під кривою робочої характеристики приймача (ROC).c Кратні зміни 27 вибраних метаболітів у групі LA порівняно з групою BN у групі відкриття.Червона колонка – активація.Синій стовпчик - спад.d–f Криві робочих характеристик приймача (ROC), що показують потужність дискримінантної моделі на основі 27 комбінацій метаболітів у наборах виявлення, внутрішньої та зовнішньої перевірки.Вихідні дані надаються у формі файлів вихідних даних.
Модель прогнозу була створена на основі зважених коефіцієнтів регресії цих 27 метаболітів (додаткова таблиця 3).Аналіз ROC на основі цих 27 метаболітів дав значення площі під кривою (AUC) 0,933, чутливість групи відкриття становила 0,868, а специфічність становила 0,859 (рис. 2d).Тим часом, серед 38 анотованих диференціальних метаболітів між LA та HC, набір із 16 метаболітів досяг AUC 0,902 з чутливістю 0,801 та специфічністю 0,856 у розрізненні LA від HC (додатковий малюнок 6a-c).Також порівнювали значення AUC на основі різних порогів кратності зміни для диференціальних метаболітів.Ми виявили, що модель класифікації найкраще розрізняла LA та BN (HC), коли рівень зміни складності було встановлено на 1,2 проти 1,5 або 2,0 (додатковий малюнок 7a, b).Модель класифікації, заснована на 27 групах метаболітів, була додатково підтверджена у внутрішніх і зовнішніх когортах.AUC становила 0,915 (чутливість 0,867, специфічність 0,811) для внутрішньої перевірки та 0,945 (чутливість 0,810, специфічність 0,979) для зовнішньої перевірки (рис. 2e, f).Щоб оцінити міжлабораторну ефективність, 40 зразків із зовнішньої когорти було проаналізовано у зовнішній лабораторії, як описано в розділі «Методи».Точність класифікації досягла AUC 0,925 (додатковий малюнок 8).Оскільки плоскоклітинний рак легенів (LUSC) є другим за поширеністю підтипом недрібноклітинного раку легенів (NSCLC) після аденокарциноми легенів (LUAD), ми також протестували підтверджену потенційну корисність метаболічних профілів.БН та 16 випадків ЛУСК.AUC розрізнення між LUSC і BN становила 0,776 (додатковий малюнок 9), що вказує на нижчу здатність порівняно з розрізненням між LUAD і BN.
Дослідження показали, що розмір вузликів на КТ-зображеннях позитивно корелює з імовірністю злоякісності та залишається основним визначальним фактором лікування вузликів25,26,27.Аналіз даних великої когорти скринінгового дослідження NELSON показав, що ризик злоякісних новоутворень у суб’єктів із вузлами <5 мм був навіть подібним до ризику у суб’єктів без вузлів 28 .Таким чином, мінімальний розмір, який вимагає регулярного моніторингу КТ, становить 5 мм, як рекомендовано Британським торакальним товариством (BTS), і 6 мм, як рекомендовано Товариством Флейшнера 29 .Однак вузли розміром понад 6 мм і без явних доброякісних ознак, які називаються невизначеними легеневими вузлами (IPN), залишаються серйозною проблемою для оцінки та лікування в клінічній практиці30,31.Далі ми перевірили, чи впливає розмір вузликів на метаболомічні ознаки, використовуючи об’єднані зразки з когорт відкриття та внутрішньої перевірки.Зосереджуючись на 27 підтверджених біомаркерах, ми спочатку порівняли профілі PCA метаболомів HC і BN менше 6 мм.Ми виявили, що більшість точок даних для HC і BN збігаються, демонструючи, що рівні метаболітів у сироватці були подібними в обох групах (рис. 3a).Карти ознак у різних діапазонах розмірів залишалися збереженими в BN та LA (рис. 3b, c), тоді як поділ спостерігався між злоякісними та доброякісними вузликами в діапазоні 6–20 мм (рис. 3d).Ця когорта мала AUC 0,927, специфічність 0,868 і чутливість 0,820 для прогнозування злоякісності вузликів розміром від 6 до 20 мм (рис. 3e, f).Наші результати показують, що класифікатор може фіксувати метаболічні зміни, спричинені ранньою злоякісною трансформацією, незалежно від розміру вузла.
ad Порівняння профілів PCA між визначеними групами на основі метаболічного класифікатора 27 метаболітів.CC і BN < 6 мм.b BN < 6 мм проти BN 6–20 мм.в ЛА 6–20 мм проти ЛА 20–30 мм.g БН 6–20 мм і ЛА 6–20 мм.GC, n = 174;BN < 6 мм, n = 153;БН 6–20 мм, n = 91;LA 6–20 мм, n = 89;LA 20–30 мм, n = 77. e Крива робочих характеристик приймача (ROC), що показує характеристики дискримінантної моделі для конкрецій 6–20 мм.f Значення ймовірності були розраховані на основі моделі логістичної регресії для вузликів розміром 6–20 мм.Сіра пунктирна лінія представляє оптимальне порогове значення (0,455).Цифри вище представляють відсоток випадків, прогнозованих для Лос-Анджелеса.Використовуйте двобічний критерій Стьюдента.PCA, аналіз головних компонентів.Площа AUC під кривою.Вихідні дані надаються у формі файлів вихідних даних.
Чотири зразки (віком 44–61 рік) із подібними розмірами легеневих вузликів (7–9 мм) були додатково відібрані для ілюстрації ефективності запропонованої моделі прогнозування злоякісності (рис. 4a, b).Під час початкового скринінгу Випадок 1 був представлений як твердий вузлик із кальцифікацією, ознакою, пов’язаною з доброякісністю, тоді як Випадок 2 був представлений як невизначений частково твердий вузлик без очевидних доброякісних ознак.Три раунди подальших КТ-сканувань показали, що ці випадки залишалися стабільними протягом 4-річного періоду і тому вважалися доброякісними вузликами (рис. 4а).Порівняно з клінічною оцінкою серійних КТ-сканувань однократний аналіз метаболітів сироватки з поточною моделлю класифікатора швидко та правильно ідентифікував ці доброякісні вузлики на основі імовірнісних обмежень (табл. 1).На малюнку 4b у випадку 3 показано вузлик із ознаками ретракції плеври, що найчастіше асоціюється зі злоякісним новоутворенням32.Випадок 4 представлений як невизначений частково твердий вузлик без ознак доброякісної причини.Усі ці випадки були прогнозовані як злоякісні відповідно до моделі класифікатора (табл. 1).Оцінка аденокарциноми легені була продемонстрована гістопатологічним дослідженням після операції резекції легені (рис. 4b).Для набору зовнішньої перевірки метаболічний класифікатор точно передбачив два випадки невизначених легеневих вузликів розміром понад 6 мм (додатковий малюнок 10).
КТ-зображення аксіального вікна легенів двох випадків доброякісних вузликів.У випадку 1 КТ через 4 роки показала стабільний твердий вузлик розміром 7 мм із кальцифікацією в правій нижній частці.У випадку 2 КТ через 5 років виявила стабільний, частково твердий вузлик діаметром 7 мм у правій верхній частці.b Комп’ютерна томографія легенів в аксіальному вікні та відповідні патологічні дослідження двох випадків аденокарциноми І стадії перед резекцією легені.У випадку 3 виявлено вузлик діаметром 8 мм у правій верхній частці з ретракцією плеври.Випадок 4 виявив частково твердий шліфований вузлик розміром 9 мм у лівій верхній частці.Фарбування гематоксиліном і еозином (H&E) резецованої легеневої тканини (масштабна шкала = 50 мкм), що демонструє ацинарну картину росту аденокарциноми легені.Стрілки вказують на вузлики, виявлені на зображеннях КТ.Зображення H&E є репрезентативними зображеннями кількох (>3) мікроскопічних полів, які досліджує патологоанатом.
Взяті разом, наші результати демонструють потенційну цінність біомаркерів сироваткових метаболітів у диференціальній діагностиці легеневих вузликів, що може створити проблеми при оцінці КТ-скринінгу.
На основі валідованої панелі диференціальних метаболітів ми намагалися визначити біологічні кореляти основних метаболічних змін.Аналіз збагачення шляху KEGG, проведений MetaboAnalyst, виявив 6 загальних значно змінених шляхів між двома даними групами (LA проти HC та LA проти BN, скоригований p ≤ 0,001, ефект > 0,01).Ці зміни характеризуються порушенням метаболізму пірувату, триптофану, ніацину та нікотинаміду, гліколізу, циклу ТЦА та пуринового обміну (рис. 5а).Потім ми додатково виконали цільову метаболоміку, щоб перевірити основні зміни за допомогою абсолютної кількісної оцінки.Визначення загальних метаболітів у зазвичай змінених шляхах за допомогою потрійної квадрупольної мас-спектрометрії (QQQ) з використанням автентичних стандартів метаболітів.Демографічні характеристики цільового зразка дослідження метаболоміки включені в Додаткову таблицю 4. Відповідно до результатів нашої глобальної метаболоміки, кількісний аналіз підтвердив, що гіпоксантин і ксантин, піруват і лактат були підвищені в LA порівняно з BN і HC (рис. 5b, c, p <0,05).Однак істотних відмінностей у цих метаболітах між BN і HC не виявлено.
Аналіз збагачення шляху KEGG значно різними метаболітами в групі LA порівняно з групами BN і HC.Використовувався двобічний глобальний тест, і значення р були скориговані за допомогою методу Холма-Бонферроні (скоригований p ≤ 0,001 і розмір ефекту > 0,01).b–d Графіки Violin, що показують рівні гіпоксантину, ксантину, лактату, пірувату та триптофану в HC, BN та LA у сироватці, визначені за допомогою LC-MS/MS (n = 70 на групу).Білі та чорні пунктирні лінії позначають медіану та квартиль відповідно.e Діаграма Violin, що показує нормалізовану експресію мРНК Log2TPM (транскриптів на мільйон) SLC7A5 і QPRT в аденокарциномі легенів (n = 513) порівняно з нормальною легеневою тканиною (n = 59) у наборі даних LUAD-TCGA.Білий квадрат представляє інтерквартильний діапазон, горизонтальна чорна лінія в центрі представляє медіану, а вертикальна чорна лінія, що тягнеться від квадрата, представляє 95% довірчий інтервал (ДІ).f Кореляційний графік Пірсона експресії SLC7A5 і GAPDH в аденокарциномі легенів (n = 513) і нормальній легеневій тканині (n = 59) у наборі даних TCGA.Сіра область представляє 95% ДІ.r, коефіцієнт кореляції Пірсона.g Нормалізовані клітинні рівні триптофану в клітинах A549, трансфікованих неспецифічним контролем shRNA (NC) і shSLC7A5 (Sh1, Sh2), визначені за допомогою LC-MS/MS.Представлено статистичний аналіз п'яти біологічно незалежних зразків у кожній групі.h Клітинний рівень NADt (загальний NAD, включаючи NAD+ і NADH) у клітинах A549 (NC) і нокдаунних клітинах A549 SLC7A5 (Sh1, Sh2).Представлено статистичний аналіз трьох біологічно незалежних зразків у кожній групі.i Гліколітичну активність клітин A549 до та після нокдауну SLC7A5 вимірювали за швидкістю позаклітинного підкислення (ECAR) (n = 4 біологічно незалежні зразки на групу).2-DG,2-дезокси-D-глюкоза.Двосторонній t-критерій Стьюдента використовувався в (b–h).У (g–i) стовпчики помилок представляють середнє значення ± стандартне відхилення, кожен експеримент проводився три рази незалежно, і результати були подібними.Вихідні дані надаються у формі файлів вихідних даних.
Враховуючи значний вплив зміненого метаболізму триптофану в групі LA, ми також оцінили рівні триптофану в сироватці крові в групах HC, BN і LA за допомогою QQQ.Ми виявили, що сироватковий триптофан був знижений у LA порівняно з HC або BN (p < 0,001, рис. 5d), що узгоджується з попередніми висновками про те, що рівні циркулюючого триптофану нижчі у пацієнтів з раком легенів, ніж у здорових осіб контрольної групи33,34. ,35.Інше дослідження з використанням ПЕТ/КТ-індикатора 11C-метил-L-триптофану виявило, що час утримування сигналу триптофану в тканині раку легенів значно збільшився порівняно з доброякісними ураженнями або нормальною тканиною36.Ми припускаємо, що зниження триптофану в сироватці LA може відображати активне поглинання триптофану клітинами раку легенів.
Також відомо, що кінцевим продуктом кінуренінового шляху катаболізму триптофану є NAD+37,38, який є важливим субстратом для реакції гліцеральдегід-3-фосфату з 1,3-бісфосфогліцератом у гліколізі39.У той час як попередні дослідження були зосереджені на ролі катаболізму триптофану в імунній регуляції, ми прагнули з’ясувати взаємодію між дисрегуляцією триптофану та гліколітичними шляхами, які спостерігалися в поточному дослідженні.Відомо, що член 5 сімейства переносників розчиненої речовини 7 (SLC7A5) є транспортером триптофану43,44,45.Фосфорибозилтрансфераза хінолінової кислоти (QPRT) — це фермент, розташований нижче за кінуреніновий шлях, який перетворює хінолінову кислоту в NAMN46.Перевірка набору даних LUAD TCGA показала, що як SLC7A5, так і QPRT були значно посилені в пухлинній тканині порівняно з нормальною тканиною (рис. 5e).Це збільшення спостерігалося на стадіях I і II, а також на стадіях III і IV аденокарциноми легенів (додатковий малюнок 11), що вказує на ранні порушення метаболізму триптофану, пов’язані з пухлиноутворенням.
Крім того, набір даних LUAD-TCGA показав позитивну кореляцію між експресією мРНК SLC7A5 та GAPDH у зразках хворих на рак (r = 0,45, p = 1,55E-26, рис. 5f).Навпаки, не було виявлено суттєвої кореляції між такими ознаками генів у нормальній легеневій тканині (r = 0,25, p = 0,06, рис. 5f).Нокдаун SLC7A5 (додатковий малюнок 12) у клітинах A549 значно знизив клітинний рівень триптофану та NAD(H) (малюнок 5g,h), що призвело до ослабленої гліколітичної активності, виміряної швидкістю позаклітинного підкислення (ECAR) (малюнок 1).5і).Таким чином, на основі метаболічних змін у сироватці крові та виявлення in vitro ми припускаємо, що метаболізм триптофану може виробляти NAD+ через кінуреніновий шлях і відігравати важливу роль у сприянні гліколізу при раку легенів.
Дослідження показали, що велика кількість невизначених легеневих вузликів, виявлених за допомогою LDCT, може призвести до необхідності додаткового обстеження, наприклад ПЕТ-КТ, біопсії легенів та надмірного лікування через хибнопозитивний діагноз злоякісності.31 Як показано на малюнку 6, наше дослідження виявило групу сироваткових метаболітів з потенційною діагностичною цінністю, яка може покращити стратифікацію ризику та подальше лікування легеневих вузликів, виявлених за допомогою КТ.
Легеневі вузлики оцінюють за допомогою низькодозової комп’ютерної томографії (LDCT) із зображеннями, що вказують на доброякісні або злоякісні причини.Невизначений результат лікування вузликів може призвести до частих повторних візитів, непотрібних втручань і надмірного лікування.Включення сироваткових метаболічних класифікаторів з діагностичною цінністю може покращити оцінку ризику та подальше лікування легеневих вузликів.ПЕТ позитронно-емісійна томографія.
Дані американського дослідження NLST і європейського дослідження NELSON показують, що скринінг груп високого ризику за допомогою низькодозової комп’ютерної томографії (LDCT) може знизити смертність від раку легенів1,3.Проте оцінка ризику та подальше клінічне лікування великої кількості випадкових легеневих вузликів, виявлених за допомогою LDCT, залишаються найбільш складними.Основною метою є оптимізація правильної класифікації існуючих протоколів на основі LDCT шляхом включення надійних біомаркерів.
Деякі молекулярні біомаркери, такі як метаболіти крові, були ідентифіковані шляхом порівняння раку легенів із здоровими особами контролю15,17.У поточному дослідженні ми зосередилися на застосуванні метаболомічного аналізу сироватки, щоб відрізнити доброякісні та злоякісні легеневі вузлики, випадково виявлені за допомогою LDCT.Ми порівняли загальний метаболом сироватки здорового контролю (HC), доброякісних легеневих вузликів (BN) та зразки аденокарциноми легені (LA) I стадії за допомогою аналізу UPLC-HRMS.Ми виявили, що HC і BN мали подібні метаболічні профілі, тоді як LA показали значні зміни порівняно з HC і BN.Ми ідентифікували два набори сироваткових метаболітів, які відрізняють LA від HC та BN.
Поточна схема ідентифікації доброякісних і злоякісних вузлів на основі LDCT в основному базується на розмірі, щільності, морфології та швидкості росту вузлів з часом30.Попередні дослідження показали, що розмір вузликів тісно пов'язаний з ймовірністю раку легенів.Навіть у пацієнтів з високим ризиком ризик злоякісної пухлини у вузлах <6 мм становить <1%.Ризик злоякісності для вузликів розміром від 6 до 20 мм коливається від 8% до 64%30.Таким чином, Fleischner Society рекомендує діаметр відрізу 6 мм для планового КТ-обстеження.29 Однак оцінка ризику та лікування невизначених легеневих вузлів (IPN) розміром понад 6 мм не проводились належним чином 31 .Сучасне лікування вроджених вад серця зазвичай базується на уважному очікуванні з частим моніторингом КТ.
Ґрунтуючись на підтвердженому метаболомі, ми вперше продемонстрували перекриття метаболомічних ознак у здорових людей і доброякісних вузликів <6 мм.Біологічна подібність узгоджується з попередніми результатами КТ, згідно з якими ризик злоякісності для вузликів <6 мм такий же низький, як і для суб’єктів без вузлів.30 Слід зазначити, що наші результати також демонструють, що доброякісні вузлики <6 мм і ≥6 мм мають високу подібність у метаболічних профілях, що свідчить про те, що функціональне визначення доброякісної етіології є послідовним незалежно від розміру вузла.Таким чином, сучасні діагностичні панелі метаболітів у сироватці крові можуть забезпечити єдиний аналіз як тест-виключення, коли вузлики спочатку виявляються на КТ, і потенційно зменшити серійний моніторинг.У той же час та сама панель метаболічних біомаркерів відрізнила злоякісні вузлики розміром ≥6 мм від доброякісних вузликів і забезпечила точні прогнози IPN подібного розміру та неоднозначних морфологічних ознак на зображеннях КТ.Цей класифікатор сироваткового метаболізму показав хороші результати у прогнозуванні злоякісності вузликів ≥6 мм із AUC 0,927.Взяті разом, наші результати вказують на те, що унікальні сироваткові метаболомічні сигнатури можуть конкретно відображати ранні метаболічні зміни, спричинені пухлиною, і мати потенційну цінність як предиктори ризику, незалежно від розміру вузлика.
Примітно, що аденокарцинома легенів (LUAD) і плоскоклітинний рак (LUSC) є основними типами недрібноклітинного раку легенів (NSCLC).Враховуючи, що LUSC тісно пов’язаний із вживанням тютюну47, а LUAD є найпоширенішою гістологією випадкових легеневих вузликів, виявлених під час КТ-скринінгу48, наша модель класифікатора була спеціально створена для зразків стадії I аденокарциноми.Ван і його колеги також зосередилися на LUAD і визначили дев'ять ліпідних сигнатур за допомогою ліпідоміки, щоб відрізнити ранню стадію раку легенів від здорових людей17.Ми перевірили поточну модель класифікатора на 16 випадках I стадії LUSC і 74 доброякісних вузликах і спостерігали низьку точність прогнозу LUSC (AUC 0,776), що свідчить про те, що LUAD і LUSC можуть мати власні метаболомічні ознаки.Дійсно, було показано, що LUAD і LUSC відрізняються за етіологією, біологічним походженням і генетичними абераціями49.Таким чином, інші типи гістології повинні бути включені в навчальні моделі для популяційного виявлення раку легенів у скринінгових програмах.
Тут ми визначили шість шляхів розвитку аденокарциноми легенів, які найчастіше змінюються, порівняно зі здоровими особами контролю та доброякісними вузликами.Ксантин і гіпоксантин є поширеними метаболітами пуринового метаболічного шляху.Згідно з нашими результатами, проміжні речовини, пов’язані з метаболізмом пуринів, були значно підвищені в сироватці або тканинах пацієнтів з аденокарциномою легені порівняно зі здоровими особами з контролю або пацієнтами на преінвазивній стадії15,50.Підвищені рівні ксантину та гіпоксантину в сироватці крові можуть вказувати на анаболізм, необхідний для швидко проліферуючих ракових клітин.Порушення регуляції метаболізму глюкози є добре відомою ознакою метаболізму раку51.Тут ми спостерігали значне збільшення пірувату та лактату в групі LA порівняно з групою HC та BN, що узгоджується з попередніми повідомленнями про аномалії гліколітичного шляху в профілях метаболомів сироватки пацієнтів з недрібноклітинним раком легенів (НДРЛ) та здоровий контроль.результати послідовні52,53.
Важливо, що ми спостерігали зворотну кореляцію між метаболізмом пірувату та триптофану в сироватці аденокарциноми легенів.Рівень триптофану в сироватці крові був знижений у групі LA порівняно з групою HC або BN.Цікаво, що попереднє великомасштабне дослідження з використанням проспективної когорти виявило, що низькі рівні циркулюючого триптофану були пов’язані з підвищеним ризиком раку легенів 54 .Триптофан є незамінною амінокислотою, яку ми отримуємо повністю з їжею.Ми робимо висновок, що дефіцит триптофану в сироватці крові при аденокарциномі легенів може відображати швидке виснаження цього метаболіту.Добре відомо, що кінцевий продукт катаболізму триптофану через кінуреніновий шлях є джерелом синтезу NAD+ de novo.Оскільки NAD+ виробляється головним чином через шлях відновлення, важливість NAD+ у метаболізмі триптофану для здоров’я та хвороби ще належить визначити46.Наш аналіз бази даних TCGA показав, що експресія транспортера розчиненої речовини триптофану 7A5 (SLC7A5) була значно підвищена в аденокарциномі легенів порівняно з нормальним контролем і позитивно корелювала з експресією гліколітичного ферменту GAPDH.Попередні дослідження в основному були зосереджені на ролі катаболізму триптофану в пригніченні протипухлинної імунної відповіді40,41,42.Тут ми демонструємо, що інгібування поглинання триптофану шляхом нокдауну SLC7A5 у клітинах раку легенів призводить до подальшого зниження клітинних рівнів NAD і супутнього ослаблення гліколітичної активності.Таким чином, наше дослідження забезпечує біологічну основу для змін у сироватковому метаболізмі, пов’язаних із злоякісною трансформацією аденокарциноми легені.
Мутації EGFR є найпоширенішими рушійними мутаціями у пацієнтів з НДКРЛ.У нашому дослідженні ми виявили, що пацієнти з мутацією EGFR (n = 41) мали загальні метаболомічні профілі, подібні до пацієнтів з EGFR дикого типу (n = 31), хоча ми виявили зниження рівня сироватки деяких пацієнтів з мутантами EGFR у пацієнтів, які приймали ацилкарнітин.Встановлена функція ацилкарнітинів полягає у транспортуванні ацильних груп із цитоплазми в мітохондріальний матрикс, що призводить до окислення жирних кислот для виробництва енергії 55 .Згідно з нашими висновками, нещодавнє дослідження також виявило подібні профілі метаболомів між мутантними EGFR і пухлинами дикого типу EGFR шляхом аналізу глобального метаболома 102 зразків тканини аденокарциноми легенів50.Цікаво, що вміст ацилкарнітину також було виявлено в групі мутантів EGFR.Таким чином, чи зміни в рівнях ацилкарнітину відображають метаболічні зміни, спричинені EGFR, і основні молекулярні шляхи можуть заслуговувати на подальше вивчення.
На закінчення наше дослідження встановлює метаболічний класифікатор сироватки для диференціальної діагностики легеневих вузликів і пропонує робочий процес, який може оптимізувати оцінку ризику та полегшити клінічне лікування на основі скринінгу КТ.
Це дослідження було схвалено Комітетом з етики онкологічної лікарні Університету Сунь Ятсена, Першою афілійованою лікарнею Університету Сунь Ятсена та Комітетом з етики онкологічної лікарні Університету Чженчжоу.У групах відкриття та внутрішньої валідації було зібрано 174 сироватки здорових людей і 244 сироватки доброякісних вузликів від осіб, які проходили щорічні медичні огляди у Департаменті контролю та профілактики раку Онкологічного центру університету Сунь Ятсена, а також 166 доброякісних вузликів.сироватка.Аденокарциноми легенів I стадії були зібрані з онкологічного центру університету Сунь Ятсена.У когорті зовнішньої валідації було 48 випадків доброякісних вузликів, 39 випадків стадії I аденокарциноми легені з Першої афілійованої лікарні Університету Сунь Ятсена та 24 випадки стадії I аденокарциноми легені з онкологічної лікарні Чженчжоу.Онкологічний центр Університету Сунь Ятсена також зібрав 16 випадків плоскоклітинного раку легенів I стадії, щоб перевірити діагностичну здатність встановленого метаболічного класифікатора (характеристики пацієнтів наведені в додатковій таблиці 5).Зразки з когорти виявлення та когорти внутрішньої перевірки були зібрані між січнем 2018 року та травнем 2020 року. Зразки для когорти зовнішньої перевірки були зібрані між серпнем 2021 року та жовтнем 2022 року. Щоб мінімізувати гендерні зміщення, приблизно однакову кількість випадків чоловіків і жінок було призначено для кожного когорта.Команда виявлення та команда внутрішньої перевірки.Стать учасника визначали на основі самозвіту.Від усіх учасників було отримано інформовану згоду, компенсація не надавалася.Суб’єктами з доброякісними вузликами були ті, у кого показники КТ-сканування стали стабільними через 2–5 років на момент аналізу, за винятком 1 випадку зразка зовнішньої перевірки, який був зібраний перед операцією та діагностований за допомогою гістопатології.За винятком хронічного бронхіту.Випадки аденокарциноми легенів були зібрані до резекції легені та підтверджені патологічним діагнозом.Зразки крові натщесерце збирали в пробірки для розділення сироватки без будь-яких антикоагулянтів.Зразки крові згортали протягом 1 години при кімнатній температурі, а потім центрифугували при 2851 × g протягом 10 хвилин при 4 °C для збору супернатанту сироватки.Аліквоти сироватки заморожували при -80°C до екстракції метаболіту.Відділ профілактики раку та медичного обстеження Онкологічного центру Університету Сунь Ятсена зібрав пул сироватки від 100 здорових донорів, включаючи однакову кількість чоловіків і жінок у віці від 40 до 55 років.Рівні об’єми кожного зразка донора змішували, отриманий пул ділили на аліквоти та зберігали при -80°C.Суміш сироватки використовували як еталонний матеріал для контролю якості та стандартизації даних.
Еталонну сироватку та тестові зразки розморожували, а метаболіти екстрагували за допомогою комбінованого методу екстракції (MTBE/метанол/вода) 56 .Коротко, 50 мкл сироватки змішували з 225 мкл крижаного метанолу та 750 мкл крижаного метил-трет-бутилового ефіру (MTBE).Перемішайте суміш та інкубуйте на льоду протягом 1 години.Потім зразки змішували та змішували на вортексі з 188 мкл води класу MS, що містила внутрішні стандарти (13C-лактат, 13C3-піруват, 13C-метіонін та 13C6-ізолейцин, придбані в Cambridge Isotope Laboratories).Потім суміш центрифугували при 15000 × g протягом 10 хвилин при 4 °C, а нижню фазу переносили у дві пробірки (по 125 мкл кожна) для аналізу РХ-МС у позитивному та негативному режимах.Нарешті, зразок випарювали насухо у високошвидкісному вакуумному концентраторі.
Висушені метаболіти розчиняли в 120 мкл 80% ацетонітрилу, перемішували протягом 5 хвилин і центрифугували при 15000 × g протягом 10 хвилин при 4 °C.Супернатанти переносили у флакони з бурштинового скла з мікровставками для дослідження метаболомії.Нецільовий метаболомічний аналіз на платформі надпродуктивної рідинної хроматографії з мас-спектрометрією високої роздільної здатності (UPLC-HRMS).Метаболіти розділяли за допомогою системи Dionex Ultimate 3000 UPLC і колонки ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 мм, 1,7 мкм, Waters).У режимі позитивних іонів рухливі фази складалися з 95% (A) і 50% ацетонітрилу (B), кожна з яких містила 10 ммоль/л ацетату амонію та 0,1% мурашиної кислоти.У негативному режимі рухливі фази А та В містили відповідно 95% та 50% ацетонітрилу, обидві фази містили 10 ммоль/л ацетату амонію, рН = 9. Програма градієнта була наступною: 0–0,5 хв, 2% В;0,5–12 хв, 2–50% B;12–14 хв, 50–98% B;14–16 хв, 98% B;16–16.1.хв, 98 –2% B;16,1–20 хв, 2% B. Колонку підтримували при 40°C, а зразок — при 10°C в автосамплері.Швидкість потоку становила 0,3 мл/хв, об’єм ін’єкції – 3 мкл.Мас-спектрометр Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) з джерелом іонізації електророзпиленням (ESI) працював у режимі повного сканування та в поєднанні з режимом моніторингу ddMS2 для збору великих обсягів даних.Параметри МС були встановлені наступним чином: напруга розпилення +3,8 кВ/- 3,2 кВ, температура капіляра 320°C, захисний газ 40 арб, допоміжний газ 10 арб, температура нагрівача зонда 350°C, діапазон сканування 70–1050 м/год, дозвіл.70 000. Дані були отримані за допомогою Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Щоб оцінити якість даних, об’єднані зразки контролю якості (QC) були створені шляхом видалення 10 мкл аліквот супернатанту з кожного зразка.На початку аналітичної послідовності було проаналізовано шість ін’єкцій зразків контролю якості, щоб оцінити стабільність системи UPLC-MS.Зразки контролю якості потім періодично вводяться в партію.Усі 11 серій зразків сироватки в цьому дослідженні були проаналізовані за допомогою РХ-МС.Аліквоти суміші пулу сироватки від 100 здорових донорів використовували як еталонний матеріал у відповідних партіях для моніторингу процесу екстракції та коригування ефектів від партії до партії.Нецільовий метаболомічний аналіз когорти відкриття, когорти внутрішньої перевірки та когорти зовнішньої перевірки було виконано в Центрі метаболомії Університету Сунь Ятсена.Зовнішня лабораторія Центру аналізу та тестування Технологічного університету Гуандун також проаналізувала 40 зразків із зовнішньої когорти, щоб перевірити ефективність моделі класифікатора.
Після екстракції та відновлення вимірювали абсолютну кількість метаболітів у сироватці за допомогою надвисокоефективної рідинної хроматографії та тандемної мас-спектрометрії (потрійний квадруполь Agilent 6495) з джерелом електророзпилювальної іонізації (ESI) у режимі моніторингу множинних реакцій (MRM).Для розділення метаболітів використовували колонку ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 мм, 1,7 мкм, Waters).Рухома фаза складалася з 90% (А) і 5% ацетонітрилу (В) з 10 ммоль/л ацетату амонію та 0,1% розчину аміаку.Програма градієнта була наступною: 0–1,5 хв, 0% B;1,5–6,5 хв, 0–15% B;6,5–8 хв, 15% B;8–8,5 хв, 15%–0% B;8,5–11,5 хв, 0%B.Колонку підтримували при 40 °C, а зразок — при 10 °C в автоматичному пробовідбірнику.Швидкість потоку становила 0,3 мл/хв, а об’єм ін’єкції становив 1 мкл.Параметри МС були встановлені наступним чином: капілярна напруга ±3,5 кВ, тиск розпилювача 35 фунтів на квадратний дюйм, потік оболонкового газу 12 л/хв, температура оболонкового газу 350°C, температура сушильного газу 250°C і потік сушильного газу 14 л/хв.Конверсії MRM триптофану, пірувату, лактату, гіпоксантину та ксантину становили 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 і 151,0–107.9 відповідно.Дані збирали за допомогою Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).У зразках сироватки триптофан, піруват, лактат, гіпоксантин і ксантин кількісно визначали за допомогою калібрувальних кривих розчинів стандартної суміші.Для зразків клітин вміст триптофану нормалізували до внутрішнього стандарту та маси клітинного білка.
Екстракцію піку (m/z і час утримання (RT)) проводили за допомогою Compound Discovery 3.1 і TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Щоб усунути різницю потенціалів між партіями, кожен характерний пік досліджуваного зразка був поділений на характерний пік еталонного матеріалу з тієї ж партії, щоб отримати відносну кількість.Відносні стандартні відхилення внутрішніх стандартів до і після стандартизації наведені в додатковій таблиці 6. Відмінності між двома групами характеризуються частотою помилкових відкриттів (FDR<0,05, ранговий критерій зі знаком Вілкоксона) і кратністю зміни (>1,2 або <0,83).Необроблені дані MS екстрагованих ознак і еталонні дані MS, скориговані за допомогою сироватки, показані в Додаткових даних 1 і Додаткових даних 2 відповідно.Пікова анотація була виконана на основі чотирьох визначених рівнів ідентифікації, включаючи ідентифіковані метаболіти, імовірно анотовані сполуки, імовірно охарактеризовані класи сполук і невідомі сполуки 22 .На основі пошуку в базі даних у Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) біологічні сполуки з MS/MS, що відповідають валідованим стандартам, або анотаціями точного збігу в mzCloud (оцінка > 85) або Chemspider були остаточно обрані як проміжні між диференціальним метаболомом.Пікові анотації для кожної функції включені в Додаткові дані 3. MetaboAnalyst 5.0 використовувався для однофакторного аналізу сумарно нормалізованої кількості метаболітів.MetaboAnalyst 5.0 також оцінив аналіз збагачення шляху KEGG на основі істотно різних метаболітів.Аналіз головних компонентів (PCA) і дискримінантний аналіз часткових найменших квадратів (PLS-DA) аналізували за допомогою пакета програмного забезпечення ropls (v.1.26.4) з нормалізацією стека та автомасштабуванням.Оптимальну модель біомаркера метаболіту для прогнозування злоякісності вузликів було створено за допомогою бінарної логістичної регресії з найменшим абсолютним скороченням і оператором вибору (LASSO, R package v.4.1-3).Продуктивність дискримінантної моделі в наборах виявлення та перевірки характеризувалася оцінкою AUC на основі аналізу ROC відповідно до пакету pROC (v.1.18.0.).Оптимальне відсічення ймовірності було отримано на основі максимального індексу Юдена моделі (чутливість + специфічність – 1).Зразки зі значеннями, меншими або вищими за порогове значення, будуть передбачувані як доброякісні вузлики та аденокарцинома легені відповідно.
Клітини A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) вирощували в середовищі F-12K, що містить 10% FBS.Послідовності коротких шпилькових РНК (shRNA), націлених на SLC7A5 і ненацілений контроль (NC), вставили в лентивірусний вектор pLKO.1-puro.Антисмислові послідовності shSLC7A5 такі: Sh1 (5'-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3'), Sh2 (5'-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3').Антитіла до SLC7A5 (#5347) і тубуліну (#2148) були придбані в Cell Signaling Technology.Антитіла до SLC7A5 і тубулін використовували в розведенні 1:1000 для вестерн-блот аналізу.
Гліколітичний стрес-тест Seahorse XF вимірює рівень позаклітинного підкислення (ECAR).Під час аналізу глюкозу, олігоміцин А та 2-DG вводили послідовно для перевірки клітинної гліколітичної здатності, виміряної за допомогою ECAR.
Клітини A549, трансфіковані нецільовим контролем (NC) і shSLC7A5 (Sh1, Sh2), поміщали на ніч у чашки діаметром 10 см.Метаболіти клітин екстрагували 1 мл крижаного 80% водного метанолу.Клітини в метанольному розчині зіскрібали, збирали в нову пробірку і центрифугували при 15000 × g протягом 15 хвилин при 4 °C.Зберіть 800 мкл супернатанту та висушіть за допомогою високошвидкісного вакуумного концентратора.Потім висушені гранули метаболіту аналізували на рівні триптофану за допомогою РХ-МС/МС, як описано вище.Клітинний рівень NAD(H) у клітинах A549 (NC і shSLC7A5) вимірювали за допомогою кількісного колориметричного набору NAD+/NADH (#K337, BioVision) відповідно до інструкцій виробника.Рівень білка вимірювали для кожного зразка, щоб нормалізувати кількість метаболітів.
Для попереднього визначення розміру вибірки статистичні методи не використовувалися.Попередні метаболомічні дослідження, спрямовані на відкриття біомаркерів15,18, розглядалися як еталони для визначення розміру, і порівняно з цими звітами наша вибірка була адекватною.З когорти дослідження не було виключено жодного зразка.Зразки сироватки були випадковим чином розподілені до групи виявлення (306 випадків, 74,6%) і групи внутрішньої перевірки (104 випадки, 25,4%) для нецільових метаболомічних досліджень.Ми також випадковим чином відібрали 70 випадків з кожної групи з набору відкриттів для цільових метаболомічних досліджень.Під час збору та аналізу даних LC-MS дослідники не бачили розподілу по групах.Статистичний аналіз даних метаболомії та експерименти на клітинах описані у відповідних розділах «Результати», «Позначення малюнків» і «Методи».Кількісне визначення клітинного триптофану, NADT і гліколітичної активності проводили тричі незалежно з ідентичними результатами.
Щоб отримати додаткові відомості про дизайн дослідження, перегляньте Анотацію звіту про природний портфоліо, пов’язану з цією статтею.
Необроблені дані MS екстрагованих ознак і нормалізовані дані MS контрольної сироватки показані в Додаткових даних 1 і Додаткових даних 2 відповідно.Пікові анотації для диференціальних характеристик представлені в Додаткових даних 3. Набір даних LUAD TCGA можна завантажити з https://portal.gdc.cancer.gov/.Вхідні дані для побудови графіка наведено у вихідних даних.Для цієї статті наведено вихідні дані.
Національна дослідницька група скринінгу легенів тощо. Зменшення смертності від раку легенів за допомогою низькодозової комп’ютерної томографії.Північна Англія.J. Med.365, 395–409 (2011).
Крамер, Б.С., Берг, К.Д., Аберлі, Д.Р. та Пророк, ПК. Скринінг раку легенів за допомогою низькодозової спіральної КТ: результати Національного дослідження скринінгу легень (NLST).J. Med.Екран 18, 109–111 (2011).
Де Конінг, Г. Дж. та ін.Зниження смертності від раку легенів за допомогою об’ємного скринінгу КТ у рандомізованому дослідженні.Північна Англія.J. Med.382, 503–513 (2020).
Час публікації: 18 вересня 2023 р