CRISPR) — це метод редагування геному третього покоління: CRISPR революціонізував світ

Кластеризовані регулярно розташовані короткі паліндромні повтори (CRISPR) – це метод редагування геному третього покоління, який революціонізував світ завдяки своїм високопродуктивним результатам. Він використовується для лікування різних біологічних захворювань та інфекцій. Різні бактерії та інші прокаріоти (такі як археї) також мають системи CRISPR/Cas9 для захисту від фагів. Повідомлялося, що стратегії на основі CRISPR/Cas9 можуть пригнічувати ріст і прогресування потрійного негативного раку молочної залози (TNBC), впливаючи на потенційно змінені гени резистентності, транскрипцію та епігенетичну регуляцію. Ці терапевтичні втручання можуть допомогти вирішити складні проблеми, такі як лікарська стійкість, що спостерігається навіть при TNBC. Наразі для доставки CRISPR/Cas9 до клітин-мішеней використовуються різні методи, такі як фізичні (мікроін'єкції, електропорація та гідродинамічні режими), вірусні (аденоасоційований вірус та лентивірус) та невірусні (ліпосоми та ліпідні наночастинки). Хоча для вивчення молекулярних причин TNBC було розроблено різні моделі, відсутність чутливих та цілеспрямованих методів для створення інструментів редагування геному in vivo обмежує їх клінічне застосування. Підсумовуючи, цей огляд всебічно розглядає прогрес, проблеми, обмеження та перспективи лікування TNBC за допомогою CRISPR/Cas9 на основі існуючих даних. Ми також виділяємо, як поєднання штучного інтелекту та машинного навчання може покращити стратегії CRISPR/Cas9 у лікуванні TNBC.
Рак характеризується неконтрольованим поділом клітин, порушенням контрольних точок клітинного циклу та мутаціями в генах-супресорах пухлин (TSG) (Matthews et al., 2022). Серед різних видів раку рак молочної залози є найпоширенішим типом раку у жінок і має високий рівень смертності в усьому світі (Waks and Winer, 2019). Рак молочної залози – це гетерогенне захворювання з різноманітними характеристиками, такими як гістологічні та біологічні особливості, клінічна картина та поведінка, а також відповідь на лікування (Weigelt et al., 2010). Класифікація раку молочної залози забезпечує точне розуміння діагностики раку молочної залози та прогнозу пухлини. Використання загальних біомаркерів та клініко-патологічних ознак було основним критерієм для класифікації раку молочної залози (Tsang and Tse, 2019). На прогноз та відповідь на лікування раку молочної залози впливають численні фактори, включаючи наявність рецептора естрогену (ER), рецептора прогестерону (PR), рецептора 2 епідермального фактора росту людини (HER2/neu), а також гістологічний ступінь, тип та розмір пухлини та метастази в лімфатичні вузли (Al-Tubaiti, 2020). Було виявлено п'ять внутрішніх молекулярних підтипів раку молочної залози, включаючи люмінальний A, люмінальний B, збагачений HER2, базальноподібний та з низьким вмістом клаудину (Prat et al., 2015). TNBC – це молекулярний підтип раку, який не експресує всі ER, PR та HER2 (Yin et al., 2020). Ці патологічні особливості пов'язані з TNBC, що підтверджує його швидке прогресування та більш агресивний характер, ніж будь-який інший тип раку молочної залози (Feng et al., 2018). Крім того, Peru et al. (2000) використовували технологію мікрочипів для перекласифікації раку молочної залози та виявлення п'яти внутрішніх підтипів раку молочної залози (Cadenas, 2012). Базальноподібний рак молочної залози – це підтип раку молочної залози, який має потрійно-негативний фенотип і пов'язаний зі швидким прогресуванням. Слід зазначити, що всі базальноподібні види раку молочної залози часто помилково діагностуються як TNBC, але лише 77% є TNBC; На противагу цьому, 71–91% випадків раку молочної залози (TNBC) мають базальну форму, що вказує на те, що ці два типи раку молочної залози перетинаються та представляють різні класифікації (Wang D.-Y. et al., 2019). Це створює потребу в характеристикі гетерогенності TNBC для з'ясування прогнозу та визначення потенційних відповідей на поточне та майбутнє лікування. Крім того, TNBC становить 15–20% усіх випадків раку молочної залози та частіше зустрічається у жінок віком до 50 років. Мутації BRCA1 або BRCA2 були зареєстровані приблизно у 20% випадків TNBC (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017). , 2020). Дослідження також показали, що TNBC має окреме імунне мікрооточення, яке включає високий рівень факторів росту судинного ендотелію, пухлинно-асоційованих макрофагів (TAM), пухлинно-інфільтруючих лімфоцитів (TIL) та інших молекул, що беруть участь у рості та міграції пухлини. Тому розуміння мікрооточення TNBC є критично важливим для його прогнозу та лікування (Fan and He, 2022).
Для оцінки прогнозу TNBC та забезпечення ефективного лікування важлива точна діагностика, що ґрунтується головним чином на імуногістохімії (IHC) для виявлення ER, PR та HER2, а також мамографії для виявлення новоутворень молочної залози. Однак мамографія не може адекватно відобразити внутрішньопухлинні ознаки, такі як некроз та фіброз (Deepak Singh et al., 2021). Оскільки поганий прогноз та діагноз заважають лікарям призначати правильні ліки (Chaudhary, 2020), для покращення догляду за пацієнтами з TNBC використовуються різні стратегії. Наразі у пацієнтів з TNBC використовуються два препарати, доксорубіцин та циклофосфамід, які показали хороші результати. Крім того, використовуються інші препарати платини, такі як карбоплатин та цисплатин (Sikov et al., 2015). Крім того, інгібітори PARP, такі як олапариб, велапариб та PF-01367338, використовуються як потенційні хіміотерапевтичні препарати для лікування TNBC (Ishino et al., 2018). Оскільки повідомлялося, що сигнальні шляхи Wnt/b-катеніну, NOTCH та Hedgehog беруть участь у виникненні та прогресуванні TNBC, цільова терапія препаратами, спрямована на ці шляхи, може бути важливою стратегією (Aysola et al., 2013). Хоча хірургія, променева терапія та хіміотерапія залишаються основою лікування TNBC сьогодні, досягнуто значного прогресу в розробці нових методів лікування, включаючи цільову терапію, імунотерапію, різні інструменти редагування генів, пов'язані з CRISPR, такі як Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, первинне редагування та генну терапію, спрямовану на CRISPR/Cas9. Тут ми зосередимося на різних інструментах редагування генів, пов'язаних з CRISPR, що використовуються в лікуванні TNBC. Серед них CRISPR/Cas9 отримав широку увагу.
Cas9n, також відомий як ніказа Cas9, — це генетично модифікований варіант білка Cas9, отриманий за допомогою системи редагування геному CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019). У своєму початковому вигляді білок Cas9 містить два нуклеазні домени: RuvC та HNH, основною функцією яких є розщеплення обох ланцюгів ДНК. Однак у Cas9n один з нуклеазних доменів, HNH, генетично мутований і стає неактивним. Тому домен HNH Cas9n залишається нефункціональним. Активним залишається лише домен RuvC, що дозволяє Cas9n розрізати або створювати розриви на окремих ланцюгах ДНК (Trevino and Zhang, 2014). Порівняно з Cas9, Cas9n може ефективно зменшувати нецільові ефекти та точно покращувати механізми репарації клітин. Cas9n може бути використаний для вирішення різних проблем, таких як створення розривів у певних місцях дволанцюгової ДНК. Для цього дві молекули Cas9n були об'єднані та використані разом (Yee, 2016). Кіназа змішаного походження 3 (MLK3) – це мітоген-активована протеїнкіназа, яка служить ключовим регулятором під час метастазування TNBC (Cronan et al., 2012).
MLK3 може активувати кілька сигнальних шляхів, що призводять до метастазування TNBC. Наприклад, шлях N-кінцевої кінази c-Jun (JNK) регулює рухливість клітин та деградацію позаклітинного матриксу, а MLK3 активує шлях JNK, тим самим посилюючи рухливість клітин та надаючи інвазивних властивостей (Rattanasinchai and Gallo, 2016). MLK3 також регулює EMT. Для цього він активує транскрипційні фактори нижче за течією, такі як Snail, Slug та Twist. Ці фактори пригнічують експресію епітеліальних маркерів та сприяють експресії мезенхімальних маркерів, що призводить до набуття метастатичного фенотипу (Casalino et al., 2023). Було відзначено, що MLK3 відіграє роль у ремоделюванні позаклітинного матриксу (ECM) та активації протеаз, таких як матриксні металопротеїнази (MMP), які деградують ECM. Це сприяє інвазії пухлинних клітин та поширенню їх у віддалені ділянки (Katari et al., 2019). Таким чином, попередні дослідження показали, що MLK3 відіграє вирішальну роль у TNBC. Раттанасінчай та Галло використовували моделі TNBC для вивчення ролі MLK3 та виявили, що він сприяє розвитку раку через специфічні сигнальні шляхи. Вони використовували CRISPR/Cas9n для редагування MLK3 та спостерігали значне зниження метастазування TNBC (Раттанасінчай та Галло, 2016).
dCas9, який часто називають неактивним Cas9, є модифікованою похідною формою білка Cas9. На відміну від активного Cas9, dCas9 не має ендонуклеазної активності, що робить його нездатним індукувати дволанцюгові розриви ДНК. Тому dCas9 можна використовувати для точного впливу на певні ділянки геному без будь-яких змін або модифікацій послідовності ДНК (Wang et al., 2016). У dCas9 два ендонуклеазні білки, RuvC та HNH, інактивуються шляхом пригнічення важливих амінокислотних залишків. (Richter et al., 2016). Незважаючи на відсутність активності розщеплення ДНК, dCas9 відіграє низку важливих ролей у генетичних дослідженнях та біотехнології. Наприклад, він дозволяє візуалізувати певні ділянки геному, полегшує регуляцію транскрипції та сприяє епігенетичним модифікаціям (Brocken et al., 2018).
Транскрипційний фактор ZEB1 (zinc finger E-box binding homeobox 1) відіграє специфічну та критичну роль у опосередкуванні епітеліально-мезенхімального переходу (EMT) – клітинного процесу, що відбувається під час ембріонального розвитку, відновлення тканин та прогресування раку. Він включає трансформацію епітеліальних клітин у мезенхімальні клітини, що призводить до змін у морфології клітин, рухливості, інвазивності тощо (Wu et al., 2020). ZEB1 інгібує численні епітеліальні маркери, такі як E-кадгерин та оклюдин, які відповідають за підтримку міжклітинної адгезії та полярності епітеліальних клітин при TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Крім того, ZEB1 активує певні маркери, такі як N-кадгерин, віментин та фібронектин (Konradi et al., 2014), а також регулює гени, що беруть участь у ремоделюванні цитоскелета, такі як Rho-GTPази та матриксні металопротеїнази (MMP) (Huang et al., 2014). 2022), крім того, він також впливає на різні сигнальні шляхи, такі як трансформуючий фактор росту-β (TGF-β), сигналізація Wnt тощо, тим самим сприяючи інвазії пухлини та метастазуванню при TNBC (Chen et al., 2016). Численні дослідження та наукові дані вказують на те, що ZEB1 має великий потенціал як цінний агент для виявлення та терапевтичного втручання при TNBC. У нещодавньому дослідженні Waryah et al. використовували модель TNBC та досягли повного пригнічення ZEB1 за допомогою dCas9. Таким чином, вони спостерігали дуже високу специфічність та майже повне пригнічення ZEB1 в умовах in vivo (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 – це інструмент редагування генів під назвою CRISPR/Cpf1. Він походить від системи CRISPR/Cas, де термін Cas12 стосується CRISPR-асоційованого білка 12 (Bharathkumar et al., 2022), який повністю подібний до Cas9. Єдина відмінність полягає в тому, що він містить білок Cas12. Порівняно з Cas9, Cas12 має деякі унікальні функції, такі як генерування липких кінців під час процесу редагування генів, тоді як Cas9 генерує тупі кінці (Wang et al., 2021). Ця властивість Cas12 сприяє його специфічній технології маніпулювання ДНК. Як білок, здатний точно розпізнавати та розрізати цільову ДНК, він має надзвичайну універсальність, що робить його ефективним інструментом для різноманітних застосувань, включаючи редагування генів (Pickar-Oliver and Gersbach, 2019).
Подібно до інших варіантів CRISPR, CRISPR/Cas12 також здатний нокаутувати або активувати гени в TNBC, впливаючи на гени, що відіграють важливу роль у його патогенезі або відповіді на лікування (Yang and Zhang, 2023). Для здійснення цього процесу була розроблена направляюча РНК (гРНК), яка спрямовує Cas12 до цільового гена. Після зв'язування Cas12 зі своєю мішенню вона вводить дволанцюгові розриви в ДНК та активує механізми репарації ДНК. Під час процесу репарації можуть бути включені неправильні нуклеотиди, що призводить до мутацій генів та втрати функції (Zhang et al., 2021a). Крім того, для активації генів також була використана вдосконалена версія ферменту Cas12 (так звана dCas12). Поєднуючи її з активатором транскрипції, можна індукувати певні гени, тим самим активуючи їх. Ця технологія має великий потенціал у сприянні активації генів-супресорів пухлин (Sultan et al., 2022).
Прайм-редагування – це нещодавно розроблена та надзвичайно досконала технологія редагування геному. Вона здатна дуже точно модифікувати ДНК організму (Chen and Liu, 2023). Прайм-редагування досягається шляхом інтеграції двох основних компонентів: модифікованого ферменту CRISPR/Cas9 та зворотної транскриптази. Роль ферменту CRISPR/Cas9 полягає у вибірковому таргетуванні точних ділянок геному, тоді як зворотна транскриптаза допомагає ретельно модифікувати ДНК у цільовому місці (Hassan et al., 2021). У механізмі редагування праймерів перший крок включає створення РНК-направляючої РНК для редагування праймерів (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Вона містить цільову послідовність та шаблон РНК, що відповідає бажаному сайту редагування в цільовій ДНК. Потім pegRNA вводиться в клітини-мішені разом з нуклеазою для редагування праймерів (PE2). PE2 – це фузійний білок, що складається з ферменту Cas9, зворотної транскриптази та адаптера для редагування праймерів (Martín-Alonso et al., 2021). Усередині клітини комплекси pegRNA та PE2 шукають конкретну ДНК, яку вони хочуть модифікувати. Фермент Cas9 розрізає ДНК та створює шаблон, що складається з окремих ланцюгів (Choi et al., 2022). Зворотна транскриптаза використовує цей шаблон для підготовки ДНК до редагування. Поряд з копіюванням ДНК, також додаються інструкції щодо редагування шаблону РНК. Нарешті, щойно створений ланцюг ДНК використовується як шаблон для відновлення розриву в ДНК, що призводить до зміненої послідовності ДНК, що містить бажану модифікацію (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Механізми редагування праймерів можуть призвести до поширених мутацій у генах. Вони можуть бути спрямовані на точкові мутації, вставки, делеції та навіть заміни генів (Anzalone et al., 2019; Chen and Liu, 2023). Праймерне редагування пропонує кілька переваг порівняно з попередніми технологіями редагування геному. До них належать підвищена точність, зменшення негативних ефектів та можливість редагувати ДНК, не покладаючись на дволанцюгові розриви ДНК (Anzalone et al., 2020).
Технологія CRISPR/Cas9 спочатку була розроблена для захисту бактерій від переносу плазмід та фагової інфекції, а пізніше була перепрофільована як ефективний інструмент для таргетування ДНК на основі РНК для редагування геному (Jiang and Doudna, 2017). Крім того, повідомлялося, що система CRISPR/Cas9 присутня у 50% та 87% бактеріальних та архейних геномів відповідно (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 є потенційним інструментом для делеції, вставки та корекції будь-якої аномальної генетичної послідовності за допомогою режимів in vivo та in vitro (Sabit et al., 2021). Більше того, було показано, що CRISPR/Cas9 є частиною адаптивної імунної системи завдяки своїй специфічності до цільових генів (Chen and Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 складається з Cas9 та однієї направляючої РНК (sgRNA). Cas9 – це ендонуклеаза, що складається з кількох білкових компонентів. Крім того, Cas9 має унікальні структурні та конформаційні властивості (Pacesa et al., 2022), оскільки складається з двох часток: розпізнавання (REC) та нуклеази (NUC). Частка REC далі поділяється на три області: REC1, REC2 та місткові спіралі (Cromwell et al., 2018). NUC складається з трьох часток, а саме: RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH та домену взаємодії з сусіднім мотивом протоспейсера (PAM) (рис. 1) (Song et al., 2016). sgRNA складається з двох компонентів, включаючи CRISPR РНК (crRNA) та транскодуючу малу РНК (трасерну РНК) (рис. 1). sgRNA з'єднує білок Cas9 з конексинами, утворюючи активний комплекс, також відомий як ефекторний комплекс (Richter et al., 2012). crRNA - це пара основ з 18–20 нуклеотидів, яка відіграє вирішальну роль у розпізнаванні послідовностей ДНК-мішеней. Крім того, crRNA з'єднується з ДНК-мішенню, а tracrRNA діє як каркас для нуклеази Cas9 для зв'язування з ДНК-мішенню (Manghwar et al., 2019). З іншого боку, послідовність PAM має 3 нуклеотиди, що підтверджує, уточнює та опосередковує зв'язування ефекторного комплексу з ДНК. Субодиниці комплексу білка Cas9 RuvC та HNH мають каталітичну активність (Richter et al., 2012; Asmamaw and Zawdie, 2021). Нуклеазний домен HNH субодиниці Cas9 розщеплює ланцюг ДНК, пов'язаний з crRNA. Нуклеазний домен RuvC розщеплює інші ланцюги ДНК та генерує дволанцюгові розриви (ДНР), після чого активуються два різні механізми репарації розривів ДНК (Jiang and Doudna, 2017) (Рисунок 1).
Рисунок 1. Огляд CRISPR/Cas9 (A). Компоненти системи CRISPR/Cas9: (i). Ендонуклеаза Cas9 відповідає за розрізання цільової послідовності ДНК, (ii) єдина направляюча (sg) РНК, що утворюється в результаті злиття химер crRNA та tra-crRNA. (два). Cas9 включає кілька компонентів, таких як Rec I, Rec II, NUC-лопатка (HNH та Ruv C є субкомпонентами) та домен взаємодії PAM (C) з відповідними функціями. Білковий комплекс CRISPR/Cas9 розщеплює послідовності ДНК на некомплементарні та комплементарні форми (D). CRISPR/Cas9 редагує геном у три етапи: розпізнавання, розрізання та репарація. Розроблена sg-РНК направляє Cas9 та розпізнає бажану послідовність через комплементарний компонент crRNA. Cas9 розпізнає послідовність PAM у 5′-NGG-3′ та розплавляє ДНК, утворюючи гібрид ДНК-РНК та активуючи розщеплення. Домен HNH гена Cas9 розщеплює комплементарний ланцюг, а домен RuvC – некомплементарний. CRISPR/Cas9 відновлює дволанцюгову ДНК (двуланцюгову ДНК), розриваючи її двома способами: негомологічне з'єднання кінців (NHEJ) та гомологічно-спрямована репарація (HDR). NHEJ відновлює дволанцюгову ДНК за відсутності чужорідної гомологічної ДНК за допомогою ферментативного процесу – схильного до помилок механізму, який може вставляти або видаляти випадкові послідовності ДНК. HDR є дуже специфічним і вимагає гомологічних шаблонів ДНК.
Шляхи репарації, опосередковані CRISPR/Cas9, включають механізми негомологічного з'єднання кінців (NHEJ) та гомологічно-спрямованої репарації (HDR). NHEJ є схильним до помилок шляхом, оскільки він включає вставку або делецію та не вимагає жодного шаблону під час механізму репарації. Він використовує випадкові нуклеотиди для створення стандартних білків (Abbasi et al., 2021). Ця система репарації складається з чотирьох комплексів, таких як комплекс KU, перехресно-комплементуючий білковий комплекс типу 4 (XRCC-4), фермент обробки кінців ДНК та протеїнкіназа DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). Білок комплексу KU має дві субодиниці, Ku 70 та Ku 80, і відіграє важливу роль у механізмі NHEJ, оскільки механізм репарації ініціюється зв'язуванням двох субодиниць (Ku 70 та Ku 80) з тупими або майже тупими кінцями цільової ДНК (Abbasi et al., 2021), слугуючи каркасом для залучення інших факторів, пов'язаних з NHEJ, до місця пошкодження (Yang et al., 2020). XRCC-4 та ДНК-лігаза складаються з 334 та 911 амінокислот відповідно, а комплекс XRCC4-ДНК-лігази IV стимулює лігування кінців ДНК (Chatterjee et al., 2015). Фермент, що обробляє кінці ДНК, також відомий як полінуклеотидкіназа 3'-фосфат, є ферментом, що обробляє кінці ДНК. Він може видаляти 3'P-групу в ДНК та фосфорилювати 5'OH-групу під час репарації DSB. Це також включає репарацію одноланцюгових розривів (SSB) за допомогою шляху репарації SSB (Chatterjee et al., 2015). Протеїнкіназа DNA-PKcs – це ДНК-залежна протеїнкіназа, що складається з каталітичної субодиниці родини PIKK (фосфатидилінозитол-3-кіназа-пов'язаних кіназ) та атаксії телеангіектазії з мутацією (ATM), а також ATM та Rad3-пов'язаних ATR, ланцюгових розривів (DSB) та одноланцюгових розривів (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR є більш точним та придатним механізмом репарації, оскільки інформація копіюється з використанням інтактної форми гомологічного дуплексу ДНК, хоча для цього потрібна присутність сестринських хроматид. Це відбувається під час фази S/G2 клітинного циклу ссавців. HDR зустрічається переважно у дріжджових видів, але NHEJ є критично важливою для ссавців (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Повний механізм репарації показано на рисунку 1.
Оскільки TNBC спричинений генетичними та епігенетичними аномаліями, корекція злоякісних геномних/епігеномних аномалій за допомогою CRISPR/Cas9 може бути розумним терапевтичним підходом (Chen et al., 2019). Крім того, деякі транскрипційні фактори, що беруть участь у клітинно-специфічній транскрипційній регуляції, можуть демонструвати унікальні характеристики ракових клітин, що свідчить про те, що транскрипційна регуляція може бути чудовим підходом до лікування раку (Drost et al., 2017). Використання цих молекулярних особливостей пухлин, таких як генетичні, епігенетичні та транскрипційні дефекти, для розробки ліків може покращити клінічні результати та зменшити витрати на скринінг. CRISPR – це потенційний інструмент редагування генів, який може не тільки виявляти та ідентифікувати геномні мішені, що викликають рак, але також може бути використаний для редагування, пригнічення та епігенетичної модифікації онкогенів у клітинах людини (Таблиця 1) (Ahmed et al., 2021). Було проведено кілька скринінгів CRISPR для пошуку генів, пов'язаних з супресорами пухлин, онкогенами та лікарською стійкістю. Використання CRISPR/Cas9 для редагування різних онкогенів TNBC показано на рисунку 2.
Рисунок 2. Редагування генів різних онкогенів TNBC за допомогою CRISPR/Cas9, що призводить до зменшення росту пухлини та метастазування. Ці онкогени включають CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 та CXCR7, Crypto1, ROR1 та ST8SIA, які беруть участь у виникненні та метастазуванні TNBC.
Міграція, інвазія та епітеліально-мезенхімальний перехід (ЕМП) ракових клітин пов'язані з ITGA9. Попередні дослідження показали, що ITGA9 є ключовим гравцем у шляху Notch та відіграє цікаву роль у метастазуванні рабдоміосаркоми (Molist et al., 2020). Крім того, було виявлено, що ITGA9 тісно пов'язаний з прогнозом пацієнтів з кількома типами пухлин, включаючи рак молочної залози (Wang Z. et al., 2019). Крім того, біоінформатичний аналіз ITGA9 показав, що його експресія в TNBC була значно вищою, ніж в інших підтипах раку молочної залози. Підвищені рівні ITGA9 пов'язані з метастазуванням пухлини та рецидивом у пацієнтів з TNBC. Нокаут ITGA9 за допомогою CRISPR/Cas9 призвів до властивостей, подібних до ракових стовбурових клітин (РСК), ангіогенезу пухлини, росту пухлини та зменшення метастазування шляхом сприяння деградації β-катеніну в TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Крипто-1 є членом родини TGF-β і має вирішальне значення для раннього ембріогенезу, підтримки стовбурових клітин та метастазування раку (Ishii et al., 2021). Також відомий як Tdgf-1, це онкогенний сигнальний білок, закріплений на GPI, який бере участь у регуляції формування первинної смужки, мезодерми та ентодерми, а також у встановленні лівої/правої асиметрії в розвитку органів тіла під час ембріогенезу (Zhang et al., 2021b). Крім того, було показано, що Cripto-1 бере участь в епітеліально-мезенхімальному переході (EMT) як маркер стовбурових клітин (Zhang et al., 2021b). EMT має вирішальне значення не лише для різних процесів, таких як ембріональний розвиток, фіброз та загоєння ран, але й для інвазії та метастазування раку. Крім того, було показано, що Cripto-1 взаємодіє з чотирма рецепторами Notch та посилює їх посттрансляційне дозрівання (Brandstadter and Maillard, 2019). Відомо, що сигнальний шлях Notch бере участь у підтримці клітин раку молочної залози людини. Дослідження показали, що нокаут Crypto-1, опосередкований CRISPR/Cas9, пригнічує ріст і метастазування раку. Таким чином, Crypto-1 може стати важливою терапевтичною мішенню для TNBC (Castro et al., 2015).
Білок XCL12 та його хемокіновий рецептор CXC (CXCR4 та CXCR7) відіграють різні ролі в проліферації, рості, міграції та інвазії ракових клітин (Wu et al., 2015). Ці хеморецептори були пов'язані з розвитком TNBC через численні сигнальні шляхи як у моделях in vivo, так і in vitro (Wu et al., 2015). Крім того, активація CXCR4 та CXCR7 пов'язана з більшою схильністю до метастазування та поганим прогнозом при TNBC (Karn et al., 2022). Таким чином, нокаут CXCR4 та CXCR7 може стати ефективними генами-мішенями для лікування раку молочної залози, включаючи TNBC. Дослідження Yang et al. Yang et al. (2019) використовували CRISPR/Cas9 для спільного нокауту генів CXCR4 та CXCR7 та виявили, що проліферація, ріст, міграція та інвазія TNBC були значно пригнічені (Yang et al., 2019).
Підвищені рівні miR-3662, онкогена TNBC, спостерігалися в тканинах раку молочної залози (Yi et al., 2022). Було показано, що нокдаун miR-3662 пригнічує ріст і метастазування пухлини раку молочної залози як in vivo, так і in vitro (Agarwal and Gupta, 2021). HBP-1 є потужним інгібітором сигналізації Wnt/-катеніну та, ймовірно, відповідає за ріст клітин TNBC, опосередкований miR-3662. Нещодавно Yi et al. виявили, що вісь miR-3662-HBP1 регулює сигнальний шлях Wnt/-катеніну в клітинах TNBC (Yi et al., 2022). Завдяки своїй пухлиноспецифічній експресії, miR-3662 може бути потенційною терапевтичною мішенню для TNBC. Таким чином, нокдаун miR-3662, опосередкований CRISPR/Cas9, може бути чудовим підходом для розробки нових препаратів для лікування TNBC.
UBR5 – це нуклеофосфопротеїн масою 300 кДа, який був ідентифікований як ключовий регулятор онкогенезу, метастазування та імунної відповіді при різних видах раку (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). Повідомлялося, що UBR5 значно підвищено регулюється у зразках TNBC та стимулює функцію ERα, індукуючи проліферацію через свою убіквітинлігазну активність (Bolt et al., 2015). Дослідження секвенування всього екзому первинних зразків TNBC також показали підвищену експресію UBR5, що свідчить про його роль у розвитку TNBC. Крім того, делеція UBR5, зумовлена ​​CRISPR/Cas9, показала значне пригнічення метастазування та росту TNBC в експериментальних моделях мишей. Більше того, включення UBR5 у модель миші дикого типу відновило його повну функціональність, тоді як цей ефект не спостерігався в інактивованих мутантних штамах (Liao et al., 2017). Відсутність UBR5 пов'язана зі збільшенням апоптозу, некрозу та пригніченням росту пухлини при TNBC через поганий ангіогенез. Через втрату UBR5 поширення пухлини у віддалені органи зменшується, а UBR5 індукує аномальний EMT, головним чином шляхом зниження експресії E-кадгерину (Zhang and Weinberg, 2018). Нещодавно було показано, що UBR5 є дуже важливим фактором у транскрипції PDL1, індукованій IFN-γ, при TNBC через відсутність убіквітинуючої активності E3. Аналіз РНК-транскриптома показав, що UBR5 може мати системний вплив на гени, пов'язані зі шляхом IFN-γ, та сприяти трансактивації PDL1 шляхом підвищення рівнів активації протеїнкіназної РНК (PKR) та її сигнальних перетворювачів та активаторів транскрипції 1 (STAT1) та регуляторного фактора інтерферону 1 (IRF1). Однак, комбінована абляція UBR5 та експресії PD-L1, опосередкована CRISPR/Cas9, має синергетичний терапевтичний ефект, ніж будь-яка з цих блокад окремо, з глибоким впливом на мікрооточення пухлини (Wu et al., 2022). Таким чином, CRISPR/Cas9 може бути важливим інструментом для пригнічення функції UBR5, тим самим пригнічуючи метастазування TNBC та ріст пухлини.
ROR1 – це трансмембранний білок I типу, який експресується під час раку та ембріонального розвитку і був ідентифікований як онкофетальний білок (Nicholas Borcherding, 2014). Інвазивна поведінка різних видів раку людини пов'язана з підвищеною регуляцією ROR1. Багатообіцяючі результати були отримані в дослідженнях in vivo та in vitro, що включають терапевтичні сполуки, спрямовані на ROR1 (Chien et al., 2016). Підвищені рівні мРНК ROR1 у біоптатах тканини молочної залози також були пов'язані з агресивними базалоподібними пухлинами молочної залози (BL) та їх міграцією в інші частини тіла. Крім того, надмірна експресія ROR1 була визначена як прогностичний маркер розвитку TNBC (Chien et al., 2016). Однак, пригнічення ROR1 за допомогою CRISPR/Cas9 для придушення росту та метастазування TNBC було б ефективною стратегією.
Процес сіалілювання включає додавання сіалової кислоти до глікокон'югатів, що каталізується сіалілтрансферазами (СТ). ST8SIA1 належить до родини СТ і відіграє важливу роль у патогенезі різних захворювань, таких як лімфолейкоз та колоректальний рак (Chang et al., 2018). Аналіз послідовності РНК показує, що ST8SIA1 високо експресується в тканині молочної залози пацієнтів з TNBC та позитивно корелює з мутаціями в гені-супресорі пухлини p53, що може сприяти патогенезу TNBC (Battula et al., 2017). Крім того, ST8SIA1 бере участь у метастазуванні та рецидиві TNBC, що свідчить про його важливу роль у виникненні та розвитку TNBC. У моделі TNBC in vitro було показано, що нокдаун ST8SIA1 за допомогою CRIPSR/Cas9 блокує ріст і метастазування (Battula et al., 2017). Це свідчить про те, що CRISPR/Cas9 може бути важливим інструментом для пригнічення функції онкогена ST8SIA1 у лікуванні TNBC.
NAT1 – це метаболічний фермент, який каталізує утворення ксенобіотичних сполук фази II та експресується майже у всіх тканинах людини. NAT1 може використовувати кофактор фолат для впливу на ацетил-КоА (ацетил-КоА) навіть за відсутності ароматичного амінного субстрату (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Дослідження показали, що NAT1 регулює функцію матриксної металопротеїнази 9 (MMP9) у моделях клітин раку молочної залози та захищає від активних форм кисню (ROS) під час глюкозного голодування (Wang et al., 2018). Було показано, що делеція NAT1 пригнічує комплекс пірувадегідрогенази, що призводить до мітохондріальної дисфункції (Wang L. et al., 2019). Крім того, різні інші дослідження показали, що інгібування NAT1 за допомогою малих молекул та придушення siRNA може зменшити інвазивність та проліферацію клітин раку молочної залози (Stepp et al., 2018). Нещодавно CRISPR/Cas9 було використано для пригнічення NAT1 у лінії клітин раку молочної залози MDA-MB-231, впливаючи на клітинний метаболізм залежно від рівня його експресії. Це дослідження також показало, що NAT-1 є критично важливим для прогресування та метастазування TNBC (Carlisle et al., 2020).
Координована транскрипція онкогенів регулюється суперенхансерами, транскрипційними факторами та кофакторами (Hnisz et al., 2015). Крім того, для регуляції транскрипції необхідна група циклінзалежних кіназ (CDK), таких як CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 та CDK13. Серед них CDK7 бере участь у фосфорилюванні РНК-полімерази II, що дуже важливо для ініціації та розширення транскрипції онкогенів у патогенезі TNBC. У фундаментальному дослідженні делеція CDK7 за допомогою CRISPR/Cas9 пригнічувала TNBC, що вказує на те, що патогенез TNBC залежить від CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Дослідження показали, що мутації в MYC та RBP (РНК-зв'язуючий білок) можуть призвести до апоптозу, тоді як окремі мутації генів у MYC або RBP не впливають на ріст ракових клітин (Einstein et al., 2021). Понад 1000 RBP у геномі людини було досліджено за допомогою бібліотеки на основі CRISPR/Cas9. Серед них 57 RBP виявилися критичними для росту ракових клітин з високо підвищеними рівнями MYC (Wheeler et al., 2020). Крім того, YTHDF2 важливий для підтримки росту клітин TNBC та зменшує кількість метильованих транскриптів під час транскрипції та трансляції високого рівня в ракових клітинах з вищою експресією MYC. Крім того, YTHDF2 не є необхідним для ракових клітин, які менш залежать від підвищених рівнів MYC для продовження виживання пацієнтів з TNBC (Einstein et al., 2021), що свідчить про те, що він може бути потенційною терапевтичною мішенню для препаратів, здатних подолати TNBC.
Білки цинкових пальців (ZNF) становлять приблизно 1% від загального геному людини. Дослідження показали, що ZNF може регулювати проліферацію клітин у різних видах раку, таких як рак печінки, рак молочної залози та колоректальний рак (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Бібліотеки, створені за допомогою нокауту CRISPR, використовувалися для скринінгу різних генів-супресорів пухлин (TSG) у клітинах раку молочної залози (Shalem et al., 2014). Відтоді транскриптомне дослідження клітин раку молочної залози з делецією ZNF319 у CRISPR/Cas9 показало, що ZNF319 є геном-супресором пухлини, який зменшує проліферацію раку молочної залози і тому бере участь у різних потенційних сигнальних механізмах та інших біологічних функціях (Wang L. et al., 2022).
Ферроптоз – це тип запрограмованої клітинної смерті, який залежить від наявності заліза. Відомо, що на розвиток фероптозу впливає наявність перекисів ліпідів. Крім того, повідомлялося, що PKCβII демонструє раннє перекисне окислення ліпідів, а підвищене перекисне окислення ліпідів пов'язане з фероптозом. Скринінг бібліотеки інгібіторів кіназ, опосередкованих CRISPR/Cas9, показав, що PKCβII бере участь у процесі перекисного окислення ліпідів, що є критичним для фероптозу в клітинах MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022). Таким чином, це свідчить про те, що нокаут PKCβII за допомогою CRISPR/Cas9 може бути потенційною мішенню гена-супресора пухлини для лікування захворювань, пов'язаних з фероптозом (Zhang et al., 2022).
Вважається, що лікарська стійкість відповідає приблизно за 90% смертей онкологічних хворих і є однією з основних проблем у лікуванні раку (Bukowski et al., 2020). Результати показують, що достатня кількість генів, пов'язаних з виведенням ліків, репарацією ДНК, апоптозом та різними шляхами клітинної сигналізації, пов'язана з лікарською стійкістю (Haider et al., 2020). Серед них кілька генів були мішенню для інструментів CRISPR/Cas9 і показали багатообіцяючі результати у зниженні лікарської стійкості та підвищенні ефективності протипухлинного лікування (Vaghari-Tabari et al., 2022). Крім того, високопродуктивні бібліотеки скринінгу нокаутів генів CRISPR/Cas9 були залучені до модифікації функції потенційних генів-мішеней лікарської стійкості (Shalem et al., 2015). Для ідентифікації генів резистентності до паклітакселу було використано секвенування РНК у поєднанні зі скринінгом бібліотеки sgRNA по всьому геному для ідентифікації восьми генів-кандидатів, включаючи гістондеацетилазу 9 (HDAC9), які пов'язані з лікарською резистентністю у пацієнтів з рецидивуючим TNBC (B et al., 2020). В іншому дослідженні спостерігалася підвищена експресія дизерину/треоніну та тирозинпротеїнкінази (DSTYK) протягом виживання пацієнтів з TNBC, які отримували протипухлинні препарати. Більше того, нокдаун DSTYK, опосередкований CRISPR/Cas9, значно посилив апоптоз лікарсько-резистентних ракових клітин in vitro (клітини SUM102PT та клітини MDA-MB-468) та на моделі TNBC in vivo (Ogbu et al., 2021).
Хоча TNBC має аномальну активацію шляху MAPK, клінічний ефект терапії, спрямованої на MEK, є слабким. Скринінг геномної бібліотеки CRISPR/Cas9 показав, що інгібування PSMG2 (шаперон 2 збірки протеому) сенсибілізує клітини TNBC BT549 та MB468 до інгібітора MEK AZD6244. Нокдаун PSMG2 за допомогою CRISPR/Cas9 змінив нормальну функцію протеасоми, що призвело до розбирання PDPK1, опосередкованого аутофагією, тим самим додатково покращуючи пухлинні клітини в моделях мишей TNBC, індукованих AZD6244 (інгібітор MEK) та MG132 (інгібітор протеасоми). Таким чином, інгібітори протеасоми та MAP-кінази (MEK) можна вводити синергічно для зменшення проліферації пухлинних клітин (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 також використовувався для скринінгу втрати функції генів, що призводить до резистентності TNBC (Shu et al., 2020). Ge та ін. пояснили механізм лікарської резистентності ракових клітин, оброблених JQ1, інгібітором бромодомену BET (BBDI), при TNBC. Використовуючи CRISPR/Cas9, вони виявили, що видалення гена rb1 призводить до того, що TNBC стає стійким до протипухлинного препарату JQ1. Отже, функція rb1 є важливою у відповіді на препарати JQ1 при TNBC. Вони також повідомили, що паклітаксел є інгібітором кінази/мікротрубочок CDK4/6, і його комбінація з BBDI, такими як JQ1, може забезпечити багатообіцяючі терапевтичні відповіді на лікарсько-резистентний TNBC (Ge et al., 2020).
Повідомлялося, що транскрипційний ландшафт довгої некодуючої РНК (днРНК) відповідає за резистентність до неоад'ювантної терапії при TNBC. Це дослідження показує, що п'ять різних транскриптів днРНК MALAT1 високо експресуються при TNBC. Крім того, делеція MALAT1, опосередкована CRISPR/Cas9, підвищила чутливість клітин TNBC BT-549 до паклітакселу та доксорубіцину, що свідчить про потенційну роль резистентності MALAT1 при TNBC (Shaath et al., 2021).
Мутації в гені BRCA1 (BRCA1m) є гетерогенними і тому їх важко виявити. Вплив на PARP1 (полі(АДФ-рибоза)полімеразу), синтетичного летального партнера BRCA1, може підвищити чутливість до препаратів TNBC до препаратів. За допомогою CRISPR/Cas9 делеція PARP1 підвищила чутливість протипухлинних препаратів, таких як доксорубіцин, гемцитабін і доцетаксел, до клітин TNBC з мутацією mBRCA1, що свідчить про те, що PARP1 також бере участь у розвитку лікарської стійкості при TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Відомо, що мутації в генах-супресорах пухлин BRCA1 або BRCA2 підвищують ймовірність розвитку раку молочної залози у людей. Лікування цих пацієнтів вимагає використання інгібіторів PARP. Крім того, було продемонстровано, що нокаут нуклеотидного фактора порятунку DNPH1 за допомогою CRISPR/Cas9 може видалити токсичний нуклеотид 5-гідроксиметилдезоксиуридин (hmdU) монофосфат, тим самим посилюючи реакцію клітин з дефіцитом BRCA на чутливість до інгібіторів PARP (Fugger та ін., 2021). Таким чином, інгібітори CRISPR/Cas9 та PARP1 можуть стати важливою стратегією лікування TNBC.
Ген пенетрантного глікопротеїну (P-gp) – це ген множинної лікарської стійкості, рівень якого зазвичай підвищений приблизно у 41% усіх випадків TNBC (Sun et al., 2020). Виведення ліків, індуковане P-gp, було визначено як ключовий регулятор лікарської стійкості при раку молочної залози. Інгібітори P-gp продемонстрували підвищену чутливість до протипухлинних препаратів при раку молочної залози (Famta et al., 2021). Таким чином, абляція або пригнічення P-gp та інгібіторів P-gp, опосередковані CRISPR/Cas9, можуть бути дуже важливими методами подолання лікарської стійкості при TNBC.
Відомо, що АТФ-зв'язуючий касетний транспортер G2 (ABCG2) викликає лікарську стійкість при TNBC (Palasuberniam et al., 2015), хоча наразі немає повідомлень про зв'язок між CRISPR/Cas9 та заглушенням ABCG2 та інактивацією генів-супресорів пухлини. PTEN може посилювати активацію ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Таким чином, використання CRISP/Ca9 для видалення ABCG2 та поєднання його з інгібітором ABCG2 може бути придатним методом лікування для подолання лікарської стійкості при TNBC. У таблиці 2 згадується CRISPR/Cas9, спрямований на всі гени резистентності.
Таблиця 2. CRISPR/Cas9 спрямований на різні гени резистентності TNBC для сенсибілізації клітин до протипухлинних препаратів.
Бібліотеки CRISPR/Cas9 є потенційними інструментами для скринінгу генних мутацій, пов'язаних з патогенезом раку (Chan et al., 2022). Цей метод скринінгу включає чотири кроки, такі як (a) конструювання бібліотеки, (b) лентивірусна трансдукція, (c) фенотипічний скринінг та (d) аналіз цільових генів. Хоча TNBC має аномальну активацію шляху MAPK, клінічний прогноз цільової терапії MEK для пацієнтів з TNBC, які несуть мутації в генах-супресорах пухлин, таких як PTEN, RB1 та TP53, дуже поганий.
Крім того, скринінг нокауту генів за допомогою CRISPR/Cas9 протестував найпотужнішу та найселективнішу молекулу, дегідрокатрол, який міститься в екстрактах квітів та листя Гватемали, щоб зрозуміти вплив дегідрокатролу на MDA-MB-231. Механізми селективної клітинної цитотоксичності. Характеристики мезенхімальної стовбуровості підтипів TNBC. Цей скринінг на основі CRISPR/Cas9 також показав, що HSD17B11, ген, що кодує 17β-гідроксистероїддегідрогеназу типу 11, високо експресується в клітинах MDA-MB-231 та призводить до утворення дегідрофалькарінолу, специфічного для клітин MDA-MB-231 (Grant et. al., 2020). Таким чином, це свідчить про те, що геномний скринінг CRISPR/Cas9 має великий потенціал у виявленні механізмів, що лежать в основі протиракових властивостей потенційних природних сполук.
Крім того, вразливість TNBC до раку вивчали за допомогою неупередженого скринінгу CRISPR/Cas9 in vivo по всьому геному, який показав зв'язок між онкогенними та пухлинно-супресорними шляхами. Повідомлялося, що ключові компоненти шляхів mTOR та Hippo відіграють важливу роль у регуляції пухлини при TNBC. Крім того, дослідження показали, що фармакологічне інгібування онкопротеїну mTORC1/2 та YAP ефективно пригнічує патогенність TNBC за допомогою моделі синергії лікарська матриця in vitro та ксенотрансплантатів, отриманих від пацієнтів in vivo. Більше того, інгібування mTORC1/2, опосередковане Torin-1, посилює макропіноцитоз, тоді як інгібування YAP, індуковане вертепорфіном, призводить до загибелі клітин TNBC. У сукупності ці результати підкреслюють силу та надійність скринінгу CRISPR in vivo по всьому геному для виявлення нових та ефективних методів лікування TNBC (Dai et al., 2021).
Порушення регуляції імунної системи є важливим фактором у онкогенезі. Ракові клітини уникають імунного очищення, минаючи захисні механізми, включаючи втручання в активність імунних клітин у мікросередовищі пухлини та порушення імунної системи. Тому розробка покращеної імунної системи може бути ключовим підходом до боротьби з пухлинами. Використання генної модифікації на основі CRISPR/Cas9 вирішує кілька проблем, пов'язаних з імунною дисфункцією, з різних точок зору. CRISPR/Cas9 використовувався для покращення протипухлинного імунітету проти раку молочної залози за допомогою таких шляхів (Рисунок 3).
Рисунок 3. Імунотерапія CRISPR/Cas9 спрямована на клітини TNBC. Втрата CDK5 та нокдаун PDL1 і CD155 посилюють імунну систему. Аналогічно, втрата A2AR та нокдаун TAA, таких як HER2, муцин 1 та TEM8, підвищили ефективність CAR-T-клітин у знищенні ракових клітин. Скринінг T-клітин за допомогою CRISPR/Cas9 показав, що порушення кінази p38 посилює протипухлинну активність T-клітин. T-клітини, модифіковані CRISPR/Cas9, збільшують експресію TCR (T-клітинного рецептора), що призводить до того, що T-клітини мають протипухлинну активність.
Мета імунотерапії — стимулювати імунну систему до атаки ракових клітин. Надмірна експресія білків імунних контрольних точок зазвичай запобігає аутоімунним реакціям, але може допомогти раковим захворюванням уникнути їх (Topalian et al., 2015). Ці білки запобігають імунним реакціям, зв'язуючись з рецепторами на поверхні імунних клітин. Кілька білків контрольних точок (таких як CD155 та PD-L1) націлені на рецептор PD-1 на імунних клітинах та експресуються в раку молочної залози, особливо TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). Нокдаун PD-L1 або його рецептора за допомогою CRISPR/Cas9 може стимулювати імунну систему до атаки пухлин TNBC (Yahata et al., 2019). Крім того, було показано, що зниження експресії PD-L1 шляхом CRISPR/Cas9-опосередкованої делеції CDK5 пригнічує ріст пухлини in vitro та in vivo (Deng et al., 2020). Пригнічення росту в моделях раку молочної залози in vitro та in vivo свідчить про те, що зниження рівня CD155, опосередковане shRNA, може мати терапевтичний ефект на рак молочної залози (Gao et al., 2018).
CAR T-клітини експресують CAR, що розпізнають пухлинно-асоційовані антигени (TAA) та можуть використовувати нокдаун контрольних білків для посилення своєї активності (Li C. et al., 2020). Існують різні потенційні мішені для CAR T-клітинної терапії при раку молочної залози, включаючи кілька TAA, таких як HER2, mucin1 та TEM8 (Bajgain et al., 2018). Існують докази того, що CAR T-клітини, що націлені на мезотелін (надмірно експресований у клітинах TNBC BT-459), є більш ефективними проти раку, коли PD-1 нокаутований за допомогою CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Однак виділення T-клітин від пацієнтів та подальше їх редагування ex vivo є трудомістким та тривалим процесом. Хоча універсальні T-клітини можуть зменшити вимоги до ізоляції, донорські T-клітини, що експресують людський лейкоцитарний антиген (HLA) класу I та T-клітинний рецептор (TCR), слід видаляти, щоб запобігти аномаліям реакції "трансплантат проти господаря" (Ren et al., 2017, 2017a). Використовуючи CRISPR/Cas9, HDR може одночасно елімінувати TCR та HLA, а також нокаутувати ген, що кодує CAR. Дослідження показали, що CRISPR/Cas9 можна використовувати для введення анти-CD19 CAR у локус TCR, тим самим ефективно продукуючи CAR без виснаження Т-клітин (Dimitri et al., 2022). Були розроблені мультиплексні технології для створення алогенних CAR T-клітин шляхом одночасного елімінування TCR, бета-2-мікроглобуліну (B2M), субодиниці HLA-I та інших білків, таких як PD-1 та CTLA-4, які можуть мати більші протиракові властивості проти TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
Використання CRISPR/Cas9 може покращити ефективність CAR-T-клітин. Відомо, що аденозин має імуносупресивні властивості та може знижувати протипухлинний імунітет, блокуючи функцію Т-клітин та активуючи аденозинові рецептори A2A (A2AR) (Vigano et al., 2019). Пригнічення A2AR за допомогою CRISPR/Cas9 значно покращило ефективність CAR-T-клітин in vivo (Giuffrida et al., 2021). Відомо, що T-клітини демонструють різні фенотипічні характеристики, такі як клітинна експансія, диференціація, оксидативний стрес та геномний стрес. Скринінг T-клітин на основі CRISPR/Cas9 виявив порушення 25 різних кіназ рецепторів T-клітин. Серед них, було показано, що делеція p38-кінази посилює протипухлинну активність T-клітин, що вказує на те, що p38-кіназа є ключовим регулятором регуляції CAR-T-клітин (Gurusamy et al., 2020).
Т-клітини можна генетично модифікувати за допомогою CRISPR/Cas9 для продукування високоекспресованих TCR. Перенесення генетично модифікованих Т-клітин пацієнтам продемонструвало сильнішу протиракову активність, ніж ендогенних Т-клітин. Отже, ендогенні TCR можуть конкурувати з генетично зміненими TCR у пацієнтів, що може вплинути на потенціал імунотерапії раку. Щоб подолати цю проблему, використання CRISPR/Cas9 для видалення ендогенного TCR-β у клітинах-реципієнтах та подальшого перенесення TCR-β Т-клітин пацієнтам з раком може демонструвати кращі протипухлинні імунні відповіді без необхідності ендогенної статевої конкуренції TCR (Fan et al., 2018). Таким чином, за винятком CRISPR-модифікованих Т-клітин, TCR у тисячу разів чутливіші до пухлинних антигенів, ніж нормальні TCR-трансдуковані Т-клітини. Крім того, при різних лейкеміях змінені Т-клітини, що генеруються γδ TCR+ CRISPR, демонструють вищу експресію CD4+ та CD8+ Т-клітин, ніж стандартне перенесення TCR (Legut et al., 2018). Таким чином, модифіковані Т-клітини, отримані за допомогою CRISPR/Cas9, можуть бути ефективним методом імунотерапії для подолання TNBC.
Інтегрини – це молекули клітинної адгезії, які присутні в клітинних трансмембранах і сприяють зв'язуванню клітин з позаклітинним матриксом (ECM) (Hamidi and Ivaska, 2018). Порушення регуляції інтегринів пов'язане з розвитком та міграцією раку шляхом зміни позаклітинного матриксу, що призводить до виживання ракових клітин у кровообігу (Hamidi and Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9-опосередкований нокдаун інтегринів уповільнює прогресування пухлини, метастазування та колонізацію при TNBC. Повідомлялося, що нокдаун інтегрину a5 (ITGA5) зменшує міграцію та прогресування клітин при інших видах раку, таких як рак легенів (Ju et al., 2017), що свідчить про те, що інтегрин a5 також може бути ключовим фактором у патогенезі TNBC.
Створення нокаутних мишей за допомогою традиційних методів ембріональних стовбурових (ЕС) клітин є трудомістким, тривалим та неефективним процесом. Потрібні місяці та роки, щоб таргетувати ЕС клітини шляхом гомологічної рекомбінації, розводити химерних мишей, а потім схрещувати їх з гетерозиготними мишами для отримання гомозиготного потомства. Для створення мишей з множинними генетичними мутаціями потрібне складне схрещування. Однак, при використанні мишей, отриманих шляхом абляції ЕС клітин за допомогою CRISPR/Cas9 або шляхом мікроін'єкції компонентів CRISPR/Cas9 в одноклітинні запліднені яйцеклітини, виникло багато проблем. Наприклад, введення змін часто відбувається в біалельних локусах і не є геноспецифічним. Нещодавно повідомлялося, що ЕС клітини, що використовують технологію CRISPR/Cas9, можуть одночасно вставляти біалельні мутації до 5 генів (Nishizono et al., 2021). Для цього мРНК Cas9 та п'ять геноспецифічних гРНК одночасно трансфікували в ЕС клітини. Це підкреслює перспективність та ефективність цієї процедури, хоча ці мутації могли бути передані, коли лінії засновників були схрещені для отримання п'ятикратних нокаутних мишей. Дослідження також повідомляє про дивовижне відкриття: ЕС-клітини більше не потрібні для створення генетично модифікованих мишей. Натомість, для видалення специфічних генних продуктів, мРНК та гРНК Cas9 були введені в ембріони на стадії одноклітинної репродуктивної системи. В результаті були створені нокаутні лінії засновників, які теоретично можна використовувати для вивчення наслідків делеції генів у мишей (Qin et al., 2016). Таким чином, CRISPR/Cas9 дозволяє створювати трансгенних мишей для лікування TNBC з меншими витратами, ніж традиційна генна інженерія. Використовуючи систему CRISPR/Cas, була розроблена нова модель нокаутної миші, яка може успішно вводити точкові мутації в один або кілька ендогенних генів у TNBC. На основі цієї концепції, тваринні моделі TNBC також можуть бути розроблені з використанням CRISPR/Cas9-опосередкованої делеції BRCA1 та p53, що призводить до втрати репарації HR, геномної нестабільності та мутантних фенотипів (Annunziato et al., 2020).
Наразі для діагностики TNBC використовуються різні методи, такі як мамографія, магнітно-резонансна томографія (МРТ) та ультразвукове дослідження. Однак ці методи мають деякі обмеження. Мамографія використовується для діагностики локальної тканини молочної залози, а не метастазів, коли ракові клітини мігрували в інші органи. Ультрасонографія не є надійним методом діагностики TNBC (Chen and Lee-Felker, 2023). МРТ має вищу чутливість, ніж ультразвукове дослідження та мамографія, але її діагностична точність обмежена (Sha and Chen, 2022). Біопсія тканини – це інвазивний спосіб виявлення ракових клітин. Однак у деяких випадках біопсія може пропустити ракову тканину, якщо голка відхилиться від області інтересу. Крім того, це дуже дорого і може бути травматичною для пацієнтки. TNBC – це гетерогенний тип раку, тому біопсія може не надати достатньо інформації про тип раку. Тому терміново потрібен новий діагностично надійний метод виявлення TNBC. CRISPR/Cas9 може служити високочутливою та малоінвазивною альтернативою для діагностики раку молочної залози. З цією метою стратегії на основі CRISPR/Cas9 можуть бути використані для покращення методів ПЛР для діагностики TNBC. Спочатку білки Cas9 та cpf1 системи CRISPR використовуються для видалення неспецифічної ДНК, а потім ці два білки (Cas9 та cpf1) можуть розпізнавати послідовність PAM перед зв'язуванням з цільовою ДНК (Deepak Singh et al., 2021). Таким чином, ПЛР може ідентифікувати мутації, пов'язані з розвитком раку. Кілька досліджень застосували цю стратегію на основі CRISPR для виявлення різних мутацій у різних видах раку (Safari et al., 2019). Таким чином, методи ПЛР на основі CRISPR можуть зменшити залежність діагностики TNBC від інвазивних методів, таких як імуногістохімія на основі біопсії.
Генотипічні зміни в регуляції гормональних рецепторів також були продемонстровані при TNBC (Chen and Russo, 2009). Стратегії ПЛР на основі CRISPR/Cas9 з використанням мікрочипів для діагностики в місці надання медичної допомоги можуть ефективно контролювати ці мутації (Hajian et al., 2019). Це також може надати медичним працівникам відповідну інформацію про специфічні мутації у пацієнтів з TNBC, що може допомогти покращити курс їхнього лікування. Однак цей комбінований метод має обмеження. Тому необхідні значні дослідницькі зусилля, перш ніж цей метод CRISPR/Cas-ПЛР можна буде використовувати в охороні здоров'я для діагностики TNBC (Yang et al., 2019).